HPLC法測(cè)定長(zhǎng)春堿親水基修飾陽離子脂質(zhì)體中主藥含量及脂質(zhì)體的包封率Δ

李學(xué)濤，喻榮平，賈連群，郭小瑞，程嵐

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

HPLC法測(cè)定長(zhǎng)春堿親水基修飾陽離子脂質(zhì)體中主藥含量及脂質(zhì)體的包封率Δ

李學(xué)濤＊，喻榮平，賈連群，郭小瑞，程嵐#

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

目的：建立測(cè)定長(zhǎng)春堿親水基修飾陽離子脂質(zhì)體中主藥含量及脂質(zhì)體的包封率的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為迪馬C18柱，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-二乙胺（13∶53∶34，V/V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm，流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μl。采用葡聚糖凝膠柱分離法分離長(zhǎng)春堿親水基修飾陽離子脂質(zhì)體游離藥物以測(cè)定包封率。結(jié)果：長(zhǎng)春堿檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.02～0.30mg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.9996）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤1.88%；低、中、高濃度的平均加樣回收率為99.82%，RSD＝0.15%（n＝9）；所測(cè)脂質(zhì)體的平均包封率為86.40%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好，可用于脂質(zhì)體的藥物含量及包封率的測(cè)定。

長(zhǎng)春堿；脂質(zhì)體；含量；包封率；測(cè)定

長(zhǎng)春堿（Vinblastine，VLB）是一種雙吲哚型生物堿，存在于夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中。VLB能干擾增殖細(xì)胞紡錘體的形成，使有絲分裂停止于中期。研究表明，VLB有免疫抑制作用，對(duì)霍杰金氏病、絨毛膜上皮癌療效較好，對(duì)急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、頭頸部癌、口咽部癌、單核細(xì)胞白血病均有一定療效[1-2]。VLB在水中的溶解度小，臨床應(yīng)用過程中表現(xiàn)出明顯的刺激性和毒副作用。為提高藥物的抗腫瘤效果，降低藥物的毒副作用，擬將VLB制備成親水基修飾陽離子脂質(zhì)體。筆者以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定該脂質(zhì)體中VLB的含量，并通過葡聚糖凝膠柱分離法測(cè)定VLB脂質(zhì)體的包封率，為該制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫LC-1100HPLC儀（G21771AA-UV檢測(cè)器、安捷倫色譜工作站）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AY220電子分析天平（日本島津公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DF2101S磁力攪拌器（鞏義市予華儀器廠）；JY92-2D超聲波細(xì)胞搗碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MiniExtruder脂質(zhì)體擠出儀（美國(guó)Avanti Polar Lipids公司）。

1.2 藥品與試劑

VLB（武漢金諾化工有限公司，批號(hào)：GPC-JNHG20110921，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.2%）；VLB對(duì)照品（貴州迪大科技有限公司，批號(hào)：GZDD-0329，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%）；VLB親水基修飾陽離子脂質(zhì)體（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號(hào)：120511、120512、120513）；3β-[N-（N’，N’-二甲基胺乙基）胺基甲酰胺基]-膽固醇（美國(guó)Avanti Polar Lipids公司，縮寫：DC-Chol，分子質(zhì)量：495.18）；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（日本精化株式會(huì)社，縮寫：DPPC，分子質(zhì)量：734.04）；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（日本精化株式會(huì)社，縮寫：PEG2000-DSPE，分子質(zhì)量：2800.5）；Sephadex G-50（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 VLB親水基修飾陽離子脂質(zhì)體的制備

結(jié)合課題的前期研究，設(shè)計(jì)VLB親水基修飾陽離子脂質(zhì)體的制備方法[3]：稱取 DPPC 0.0370g、DC-Chol 0.0252g、PEG2000-DSPE 0.0010g，精密稱定，加氯仿20ml使其溶解，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去氯仿，制備磷脂薄膜。加pH 3.0的檸檬酸緩沖液30ml，水化磷脂薄膜，緩慢振搖，60℃水浴，磁力攪拌30min，超聲波處理30min，制備空白脂質(zhì)體。將所得脂質(zhì)體依次通過0.45、0.22μm微孔濾膜濾過，加入0.2mol/L VLB溶液4.44ml，并用l mol/L磷酸氫二鈉將pH調(diào)至7.5，于55℃水浴保溫10min，冷卻至室溫，即得。

2.2 脂質(zhì)體中主藥含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件[4]色譜柱：迪馬C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-二乙胺（13∶53∶34，V/V/V）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：281nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl。

2.2.2 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：精密量取VLB親水基修飾陽離子脂質(zhì)體1.0ml，加甲醇9.0ml，超聲處理（功率：250W，頻率：40kHz）10min，破乳，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液適量，即得。（2）對(duì)照品溶液的制備：取VLB對(duì)照品30.0mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至100ml，得質(zhì)量濃度為0.30mg/ml的對(duì)照品溶液。（3）空白溶液的制備：制備不含VLB的空白脂質(zhì)體，再按供試品溶液方法制備，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、空白溶液和供試品溶液各10μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間約為8.4min，空白在此位置沒有色譜峰，對(duì)VLB的測(cè)定無干擾。理論板數(shù)按VLB計(jì)不低于3000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30mg/ml的系列溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，VLB檢測(cè)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝5481.4x+80.571（r＝0.9996）。結(jié)果表明，VLB檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.02～0.30mg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下線性范圍內(nèi)的3種質(zhì)量濃度（0.02、0.15、0.30mg/ml）的對(duì)照品溶液適量，每種濃度3份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.88%，說明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為120511的樣品適量，在常溫放置下分別于0、2、4、6、8、12h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.64%，表明樣品溶液在12h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.空白；C.供試品Fig1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.blank；C.test sample

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為120511的樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，平行測(cè)定6次。結(jié)果，樣品的平均質(zhì)量濃度為0.2514mg/ml，RSD＝1.86%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取批號(hào)為120511的樣品1.0ml，共9份，分別加入對(duì)照品溶液（0.05mg/ml）4.0、5.0、6.0ml，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab1 Results of recovery tests（n＝9）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 精密量取不同批號(hào)的樣品1.0ml，各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定和計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

2.3 VLB脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

2.3.1 洗脫曲線的繪制[5-6]稱取Sephadex G-502.0g，加pH 7.6磷酸鹽緩沖液，浸泡24h，濕法裝柱。精密吸取樣品（批號(hào)：120511）0.5ml，加至凝膠柱（1.0cm×12cm）上方，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫速度1.0ml/min，收集洗脫液，每份2ml，分別吸取1ml，加蒸餾水1ml，混勻，超聲使其澄清，以洗脫溶液為空白，于281nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，結(jié)果見圖2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab2 Results of content determination of samples（n＝3）

圖2 洗脫曲線Fig2 Plot of elution of curves

2.3.2 上柱回收率的測(cè)定 吸取3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液（0.02、0.15、0.30mg/ml）各0.5ml，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分離，合并游離組分，測(cè)定VLB含量。結(jié)果，VLB柱回收率＝102.5%，RSD＝1.41%（n＝3）。取質(zhì)量濃度為0.02、0.15、0.30mg/ml的對(duì)照品溶液各適量，分別加入空白脂質(zhì)體，混合均勻，精密移取0.5ml，上柱，洗脫，收集游離藥物，測(cè)定含量。結(jié)果，平均加樣回收率為100.4%，RSD＝1.75%（n＝3）。

2.3.3 包封率的測(cè)定 取不同批號(hào)VLB脂質(zhì)體各3份，分別精密吸取0.5ml，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，收集游離藥物，合并，混勻，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，濾過，濾液定容至5ml，以0.22μm微孔濾膜濾過，取濾液10μl測(cè)定，計(jì)算VLB的質(zhì)量濃度，按照以下公式計(jì)算脂質(zhì)體的包封率：

式中，Mt為VLB總量，My為未被脂質(zhì)體包封的VLB的量。3批VLB脂質(zhì)體包封率的測(cè)定結(jié)果詳見表3。

表3 包封率的測(cè)定結(jié)果（%%，n＝3）Tab3 Result of encapsulation rate（%%，n＝3）

3 討論

3.1 包封率測(cè)定方法的選擇

分離脂質(zhì)體中游離藥物的方法有葡聚糖凝膠柱分離法（凝膠濾過色譜分離法）、魚精蛋白沉淀法、透析法、反透析法、微柱離心法[7-10]等。在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白沉淀法在沉淀脂質(zhì)體時(shí)，魚精蛋白對(duì)游離的藥物有一定的吸附沉淀作用；采用透析法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，透析過程操作時(shí)間過長(zhǎng)；反透析法雖然可以彌補(bǔ)透析法的不足，但需要將透析袋置于脂質(zhì)體溶液中，所耗脂質(zhì)體較多，成本較高；微柱離心法在離心過程中可能發(fā)生脂質(zhì)體變形或破裂而導(dǎo)致包封率下降。故筆者采用葡聚糖凝膠柱分離法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率。結(jié)果表明，本法操作簡(jiǎn)單、快捷、藥物分離效果較好。

3.2 影響脂質(zhì)體包封率的因素

影響脂質(zhì)體包封率的因素主要為藥物本身的性質(zhì)。脂溶性或水溶性較好的藥物的包封率較高，藥物的荷電性、分子質(zhì)量及其濃度等對(duì)包封率也有影響。在制備脂質(zhì)體時(shí)，類脂膜的組成對(duì)包封率也有影響，加入適量的膽固醇可以提高包封率。另外，脂質(zhì)體的制備方法對(duì)包封率也有很大的影響。

3.3 含量測(cè)定時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)筆者前期對(duì)VLB親水基修飾陽離子脂質(zhì)體的研究發(fā)現(xiàn)，VLB在264nm波長(zhǎng)處有最大光譜吸收，因此本試驗(yàn)選擇HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為264nm。VLB測(cè)定中所用的流動(dòng)相為乙腈-甲醇-二乙胺溶液（取二乙胺14ml，加水986ml，混勻，磷酸調(diào)pH至7.5）的混合液，分別考察不同體積比（13∶53∶34，10∶50∶40，7∶47∶46）對(duì)VLB保留時(shí)間的影響。結(jié)果，流動(dòng)相體積比為34∶66時(shí)VLB的保留時(shí)間為10.9min，峰形對(duì)稱，故確定流動(dòng)相乙腈-甲醇-二乙胺體積比為13∶53∶34。

綜上所述，本研究確定的HPLC測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好。采用葡聚糖凝膠柱分離法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，方法操作簡(jiǎn)單、快捷、藥物分離效果較好，可用于制劑包封率的測(cè)定。

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Determination of the Content of Main Component and Entrapment Efficiency of Vinblastine Hydrophilic Group Modified Cationic Liposome by HPLC

LI Xue-tao，YU Rong-ping，JIA Lian-qun，GUO Xiao-rui，CHENG Lan
（School of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Liaoning Dalian 116600，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of main component and the entrapment efficiency of Vinblastine hydrophilic group modified cationic liposomes.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was carried out on C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-diethylamine（13∶53∶34，V/V/V）at the flow rate of 1.0ml/min.The column temperature was at 30℃ and the sample size was 10μl.The free drug of Vinblastine hydrophilic group modified cationic liposomes was separated by sephadex column so as to detect the encapsulation rate.RESULTS：The linear range of vinblastine were 0.02-0.30mg/ml（r＝0.9996）with an average recovery of 99.82%（RSD＝0.15%，n＝9）.RSDs of precision，stability，and repeatability tests were all≤1.88%.The average encapsulation rate was 86.40%.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple，rapid and reproducible，and it can be used for the determination of the content and encapsulation rate of liposomes.

Vinblastine；Liposome；Content；Encapsulation rate；Determination

R979.1

A

1001-0408（2014）04-0369-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2014.04.27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81102822）；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年藥學(xué)人才基金（No.yxrc0911）

＊副教授。研究方向：新型給藥系統(tǒng)。E-mail：lixuetao1979@163.com

#通信作者：教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：新藥開發(fā)。電話：0411-87586010。E-mail：sychenglan@163.com

2013-05-22

2013-11-24）