HPLC法同時測定補中益氣丸中3種活性成分的含量

薛薇，毛菊華，王志芳

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥學部，南寧 530011；2.麗水市食品藥品檢驗所，浙江麗水 323000；3.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 510663）

HPLC法同時測定補中益氣丸中3種活性成分的含量

薛薇1＊，毛菊華2，王志芳3

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥學部，南寧 530011；2.麗水市食品藥品檢驗所，浙江麗水 323000；3.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 510663）

目的：建立同時測定補中益氣丸中橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸含量的方法。方法：采用高相液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為260nm，進樣量為10μl。結果：橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的檢測質量濃度分別在0.0615～1.250、0.0255～0.510、0.0506～1.012mg/ml范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.9997、0.9998、0.9999）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD≤0.98%；平均加樣回收率分別為99.19%、99.42%、101.13%，RSD分別為2.05%、2.43%、2.16%（n＝9）。結論：該方法準確、可靠、簡便易行，可用于補中益氣丸的質量控制。

高效液相色譜法；補中益氣丸；橙皮苷；毛蕊異黃酮苷；甘草酸

補中益氣丸為常用補中益氣藥，原方為金元時期著名醫家李東垣在其《脾胃論》中論述的“補中益氣湯”方，方中黃芪為君藥，黨參、白術、甘草（炙）為臣藥，當歸、陳皮為佐藥；升麻、柴胡為使藥?，F代研究表明，補中益氣湯具有抗潰瘍、調節免疫、抗胃黏膜損傷及調節激素等功效[1-4]。2010年版《中國藥典》[5]中關于補中益氣丸的質量控制僅為測定黃芪甲苷，但補中益氣丸中有效成分較多，有文獻報道，補中益氣丸方中橙皮苷、毛蕊異黃酮苷和甘草酸均為有效成分[6-7]。因此，僅以檢測黃芪甲苷作為衡量其質量的標準，具有一定的片面性，從而導致不同廠家生產的補中益氣丸質量不一。目前，國內文獻報道僅分別對補中益氣丸中黃芪甲苷、橙皮甘、甘草酸的含量進行測定[8-9]，并未對多個指標建立同時測定的方法。鑒于中藥復方制劑化學成分的復雜性，為保證藥品質量，筆者嘗試采用高效液相色譜（HLPC）法同時測定補中益氣丸中3種主要活性成分的含量。

1 材料

Summit P680HPLC儀，包括Summit P680A低壓四元泵、DIONEX-UVD170U紫外檢測器、ASI-100自動進樣器、Chromelon色譜工作站（美國戴安公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S6數顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；XS225A型分析天平（德國Sartorius公司）。

橙皮苷對照品（成都植標化純生物技術有限公司，批號：120316）；毛蕊異黃酮苷、甘草酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130111、121124）；補中益氣丸（A公司，批號：201211027、201304034；B公司，批號：12082027；C公司，批號：121108；D公司，批號：N00014；E公司，批號：11D229；F公司，批號：130412）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；水（純凈水，華潤怡寶食品飲料有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：260nm；進樣量：10μl。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution of mobile phase

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取補中益氣丸，切碎，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定質量，超聲處理60min（功率：500W，頻率：40kHz），放冷，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，用0.45μm孔徑微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品、毛蕊異黃酮苷對照品、甘草酸對照品適量，置于同一10ml棕色量瓶中，加入甲醇溶解并稀至刻度，搖勻，即得3種成分質量濃度分別為0.510、1.250、1.012mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 空白溶液的制備 按補中益氣丸處方比例制成不含黃芪、陳皮、甘草（炙）的空白對照品，按“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制備空白溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取“2.2”項下供試品溶液、對照品溶液、空白溶液各10μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，3種成分可達到基線分離。理論板數按橙皮苷峰計算應不低于5000。

圖1 高效液相色譜圖A.空白；B.對照品；C.供試品1.毛蕊異黃酮苷；2.橙皮苷；3.甘草酸Fig1 HPLC chromatogramsA.blank；B.substance control；C.test samples；1.calycosin glycoside；2.hesperidin；3.glycyrrhizic

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液1、0.75、0.5、0.2、0.1、0.05ml，置于1ml量瓶中，分別以甲醇定容至刻度，搖勻，得到不同質量濃度的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以檢測質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab2 Results of regression equation and linear range of 3components

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。結果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.24%、0.98%、0.79%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液（批號：201211027）適量，分別于放置0、4、8、12、16、20、24h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.91%、0.26%、0.67%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取樣品（批號：201211027）內容物適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.49%、0.67%、0.98%，表明本方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：201211027）內容物約0.2g，共9份，分別加入一定量的橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab3 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取7批補中益氣丸樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算3種成分含量，結果見表4。

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者曾嘗試了分別采用甲醇-水與乙腈-水按不同的比例作為流動相進行測定，結果發現，3種待測成分的分離度均不理想，目標峰拖尾較嚴重；又嘗試改為甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進行測定，結果發現，甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時，3種待測成分分離度均較好且峰形最佳。因此，選擇甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相。

表4 樣品含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab4 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3.2 檢測波長的選擇

取對照品溶液在210～400nm波長范圍內進行檢測，結果可見，橙皮苷在280nm波長附近處有最大吸收，毛蕊異黃酮苷在260nm波長處有最大吸收，甘草酸在240nm波長處有最大吸收。當在260nm波長時，3種待測成分分離度均良好，可滿足定量測定要求，故選擇260nm為檢測波長。

3.3 柱溫的選擇

取供試品溶液在選定的流動相及波長條件下觀察了20、25、30、35℃等不同柱溫對各成分分離效果的影響，結果發現，當柱溫為30℃時，3種待測成分分離度均較好且峰形最佳。

綜上所述，本方法準確、可靠、簡便易行，可用于補中益氣丸的質量控制。

[1] 劉曉玲，王汝俊，付銓盛.補中益氣湯對脾虛大鼠胃黏膜MEK/ERK mRNA表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：5.

[2] 高璟春，張金超，陳瑤，等.補中益氣湯的LC-MS分析及其對免疫抑制小鼠的調節作用[J].中草藥，2006，37（8）：1134.

[3] 許琦，王建華，王汝俊，等.補中益氣湯對脾虛大鼠胃泌素受體結合作用的影響及其對胃黏膜損傷的保護機制[J].廣州中醫藥大學學報，2003，20（1）：51.

[4] 曾昭明，陳芝喜，趙慧，等.補中益氣丸對脾虛大鼠甲狀腺激素水平的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2007，24（4）：320.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：780-781.

[6] 李洪剛，熊勝元，楊修齊，等.高效液相色譜法測定補中益氣丸中甘草酸含量[J].中國藥業，2005，14（7）：43.

[7] 李苑，柯雪紅，陳為，等.補中益氣湯不同配伍對橙皮苷含量的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20（3）：262.

[8] 徐端瓊.高效液相色譜法測定補中益氣丸中橙皮苷的含量[J].海峽藥學，2007，19（3）：48.

[9] 柯雪紅，花汝風，陳錦富，等.補中益氣湯中甘草酸含量測定及配伍對其影響[J].中成藥，2009，31（2）：245.

Simultaneous Determination of 3Active Constituents in Buzhong Yiqi Pills by HPLC

XUE Wei1，MAO Ju-hua2，WANG Zhi-fang3
（1.Dept.of Pharmacy，Ruikang Hospital of Guangxi University of TCM，Nanning 530011，China；2.Lishui Institute for Food and Drug Control，Zhejiang Lishui 323000，China；3.Guangzhou Xiangxue Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of hesperidin，calycosin glycoside and glycyrrhizic acid in Buzhong yiqi pills.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18column with mobile phase consisted of methanol-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃，and the detection wavelength was set at 260nm.The sample size was 10μl.RESULTS：The linear ranges were 0.0615-1.250mg/ml for hesperidin（r＝0.9997），0.0255-0.510mg/ml for calycosin glycoside（r＝0.9998）and 0.0506-1.011mg/ml for glycyrrhizic acid（r＝0.9999）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 0.98%.Average recoveries were 99.19%（RSD＝2.05%，n＝9），99.42%（RSD＝2.43%，n＝9）and 101.13%（RSD＝2.16%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple and feasible，and can be used for the quality control of Buzhong yiqi pills.

HPLC；Buzhong yiqi pills；Hesperidin；Calycosin glycoside；Glycyrrhizic

R917

A

1001-0408（2014）16-1524-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2014.16.30

＊碩士。研究方向：醫院藥學。電話：0771-2188297。E-mail：xw5346@foxmail.com

2013-12-06

2014-01-05）

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