CIK細胞在肝癌治療中的研究進展

譚智勇黃 婕龔建平*

（1 重慶云陽縣醫院外科，重慶 404500；2 重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科，重慶 400010）

CIK細胞在肝癌治療中的研究進展

譚智勇1黃 婕1龔建平2*

（1 重慶云陽縣醫院外科，重慶 404500；2 重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科，重慶 400010）

肝細胞癌是肝臟腫瘤中最常見的組織學類型，也是全世界第三常見的癌癥，嚴重威脅到人類的健康。手術切除、肝動脈化療栓塞術（TACE）以及射頻消融（RFA）是目前治療肝細胞癌的主要手段。但其復發率較高，長期生存率仍不容樂觀。由于免疫細胞在惡性腫瘤治療上的巨大潛力，近年來過繼免疫治療已成為一個重要的研究方向。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）因其在腫瘤免疫治療上的獨特特征而備受關注。本文旨在介紹該細胞的基本特征并綜述其在肝癌治療中的研究進展。

過繼免疫治療；CIK細胞；肝細胞癌

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝臟腫瘤中最常見的組織學類型，也是全世界第三常見的癌癥，其惡性度高，嚴重威脅到人類的健康[1]。除肝移植以外，目前手術切除、肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）以及射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）仍是治療的主要手段[2]。雖然肝臟手術技術以及早期診斷方法相比以前有了很大進步，但是由于患者固有免疫及特異性免疫功能低下，切除不徹底及其對放、化療不敏感以及治療過程中產生的毒副作用等相關因素，肝癌的復發和肝外轉移率較高，長期生存率仍不容樂觀，大約80%的患者在確診后1年內死亡。因此，在肝癌治療中尋找一種有效的方法來加強傳統治療手段的療效顯得尤其重要。

基于免疫細胞在腫瘤治療方面的巨大潛力，生物治療已成為腫瘤綜合治療的第四種模式并且越來越受到重視。據報道[3-6]，已有多種免疫細胞如樹突狀細胞（dentritic cells，DC）、細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）、自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）、淋巴因子激活殺傷細胞（lymphokine-activated killer cells，LAK）、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）在腫瘤治療的研究及臨床應用中展現了不同程度的效果。與上述細胞相比，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺傷腫瘤細胞功能，且其增殖率高毒副作用較少，使之迅速成為了腫瘤免疫治療的研究焦點。

1 CIK細胞的來源

Schmidt-Wolf等[7]于1991年首次報道了CIK細胞。有文獻將CIK細胞定義為通過體內獲得的外周血單個核細胞（peripheral blood monocytes，PBMC）與多種細胞因子共同培養所獲得的多克隆效應T細胞[8]。研究[9]認為CIK細胞的前體細胞是未成熟CD4CD8雙陰性表型的CD3+T淋巴細胞，但這種細胞在外周血中含量極小（1%～5%）。若要將其用于腫瘤的臨床治療則先需要在體外擴增培養以獲得大量CIK細胞[10]。CIK細胞種類及比例因培養條件的變化而不同[11]，這里僅對傳統CIK細胞擴增步驟做簡單介紹：首先利用密度梯度離心法分離外周血中（自體或異體）從而得到PBMC細胞。所得的PBMC與含有IFN-γ的介質培養1 d，之后又在包含抗CD3抗體、IL-2以及IL-1β等介質中培養20余天。在培養的終末階段，CD3+的T淋巴細胞最終成為有兩個主要亞群的異質群體，即CD3+CD56+T細胞和CD3+CD56-T細胞。第30天時，擴增的CIK細胞中大約有30%的細胞表型為CD3+CD56+，與培養開始時相比，其絕對數量也大概增加了1000倍。其中CD3+CD56+T細胞被認為是通過非主要組織相容性復合體（major histocompatibility antigens，MHC）限制性途徑而發揮抗腫瘤作用的生力軍。

CIK細胞的產生是由是多種外源性細胞因子共同誘導培養。多種細胞因子的作用是相互協同，單一因子對效應細胞的增殖及細胞毒活性無作用或者小于多種細胞因子的聯合作用。需注意的是不同的外源性細胞因子也所起作用不同，如抗CD3抗體用于激發T細胞增殖，而IFN-γ、IL-1β以及TNF-α則用于增加其細胞毒活性。IL-2在CIK細胞擴增中起著關鍵作用，它能同時刺激細胞數量以及細胞毒活性的增長[12]。

2 CIK細胞殺傷腫瘤的分子作用機制

對于急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）、慢性髓性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）以及B淋巴細胞瘤等一系列腫瘤細胞，CIK細胞有著強大細胞毒性作用。除上述血液系統腫瘤細胞外，CIK細胞在治療實體腫瘤（肝癌、胃癌、肺癌等）的過程中在體內也表現出了有效的抗腫瘤作用[13,14]。雖然CIK細胞在競爭性抗CD3單克隆抗體或易感腫瘤靶細胞的刺激下能夠對細胞外間隙進行具有細胞毒性的脫顆粒，這些顆粒能穿透靶細胞膜，導致腫 瘤細胞的裂解，但是刺激這一活動的惡性細胞上的分子結構并未涉及MHCTCR的相互作用。中和CD3或者HLA-I類單克隆抗體也不能抑制腫瘤細胞激活的其細胞溶解活性。此外，環孢菌素（cyclosporin，CsA）和FK506能夠抑制抗CD3介導的脫粒，但這并不會影響CIK細胞對腫瘤靶細胞的細胞毒性。CIK介導的針對腫瘤細胞的細胞毒性是CIK細胞與靶細胞結合及其與腫瘤細胞形成細胞偶合物的必要條件。白細胞功能相關抗原-1（leukocyte function associated antigen-1，LFA-1）是附著于細胞表面的一種分子，它與效應細胞/靶細胞識別以及偶合物形成的穩定有關。CIK細胞表達LFA-1，而最易感的腫瘤細胞表達許多LFA-1配體（ICAM-1，-2，-3等）。抗LFA-1單克隆抗體能夠強烈抑制CIK-腫瘤細胞偶合物形成及其針對腫瘤細胞的細胞毒性。上述結果表明LFA-1在靶細胞綁定以及CIK細胞介導的細胞毒活性的實現中起著關鍵作用。研究表明，除表面附著分子外，CIK細胞還表達活化NK細胞受體如：NKG2D、DNAM-1以及表達較低的NKp30。NKG2D對于普通的T淋巴細胞有協同刺激作用，而CIK細胞上表達的NKG2D則通過體外IL2激活和DAP10配體分子上調從而實現了腫瘤受體的功能。NKG2D識別的主要靶點是MIC A/B（MHC-I類相關分子）以及ULBP家族（ULPBs 1，2，3）[15]。而在腫瘤細胞中MIC A/B、ULBPs等有著較高的表達。NKG2D、DNAM-1或NKp30等細胞信號通路會使CIK細胞活化進而導致其脫顆粒并產生細胞毒活性作用，最終通過穿孔素以及顆粒酶介導來殺傷腫瘤細胞。DAP10的表達上調還可以把NKG2D介導的信號通路和穿孔素介導的細胞毒活性的有效結合起來。MIC A/B是一種損傷誘導的蛋白，在很多惡性或變性的細胞中都有表達。它們的表達為非MHC限制性且沒有某種特定的組織形態。根據腫瘤表型的生物學行為以及浸潤性的變異理論，在同一類型的腫瘤中上述配體的表達可能不同。Sangiolo D等[16]研究表明，在區妥昔單抗耐藥的乳腺癌臨床前模型中，可伴有腫瘤細胞MIC A/B表達增高。這也最終導致其對于CIK細胞免疫介導的殺傷的易感性增加。用抗體消除NKG2D、DNAM-1以及NKp30的實驗結果進一步證實了上述分子與CIK細胞的TCR無關腫瘤細胞識別及殺傷有著密切關聯。

3 CIK細胞治療腫瘤的動物研究

在不同的體內外實驗中，CIK細胞對于不同的腫瘤細胞都展現出了較強的抗腫瘤能力。Kim等[17]實驗發現，在30∶1（效靶比）的比例下，CIK細胞殺死了大約58%的人MKN74胃癌細胞。此外在裸鼠的異種移植模型中，向兩只小鼠分別注入3×106個和1×107個CIK細胞時，利用MKN74癌細胞接種產生的腫瘤體重可分別減輕58%和78%。在針對神經膠質瘤以及肺癌細胞的實驗中也得到了相似的結論。當CIK細胞與靶細胞之比為30∶1時，CIK細胞清除了43%的U-87 MG神經膠質瘤細胞以及98%NCI-H460肺癌細胞；相應癌細胞接種產生的腫瘤體重也隨著CIK細胞的劑量增加而減輕[18,19]。

4 CIK細胞用于肝癌治療的研究進展

與腫瘤免疫學相關的研究表明患者的細胞免疫功能與癌癥的發生發展密切相關，我國原發性肝癌的主要病因主要是乙型肝炎病毒感染，而在肝炎病毒感染者中均存在不同程度的免疫功能缺陷。免疫治療的主要策略是通過免疫細胞或因子刺激并恢復機體自身的免疫功能從而達到對抗并消除疾病的目的[11]。CIK細胞以其強大的體外擴增能力、非MHC限制性抗腫瘤活性、高效的細胞毒活性以及相對較少的副作用（發熱、寒戰）等特征迅速成為了過繼免疫治療的主力軍。它不僅副作用小，同時還能避免腫瘤的免疫逃逸以及腫瘤抗原的特異性耐受[20]。研究表明CIK細胞治療具有改善患者生活質量、延長生存期以及減緩復發等優點，是繼手術、放射治療、化學治療后的又一種新型有效的治療手段。現階段臨床CIK細胞肝癌治療的臨床應用主要包括以下幾種。

4.1 手術后鞏固治療

早期肝癌的治療仍以手術切除為主，但術后患者體內可能有微小病灶殘余，這也和肝癌術后復發與轉移相關。若手術后予以CIK細胞治療，不僅可以消除目前影像學檢查等無法檢測到的殘留腫瘤細胞，而且還可以幫助患者盡快恢復和提高機體免疫力，改善生活質量[21]。國內一項關于肝癌根治性切除術后輔以CIK細胞治療的隨機對照試驗將127位患者分為3組，其中41個患者在術后加以3個療程的CIK細胞治療（CIK組一），43個患者在術后予以6個療程CIK細胞治療（CIK組二），余下43人術后不作任何處理（對照組）。該實驗結果表明CIK組一及CIK組二的無疾病生存率要明顯高于對照組，但兩CIK組之間的無疾病生存率差別無明顯統計學意義，且3個組的總體生存率差異也無明顯統計學意義。該實驗認為：肝癌根治術后予以CIK細胞輔助治療可以預防術后癌癥的轉移與復發，但并不能提高總體生存率[22]。國外有研究也得出了相似的結論，該文獻報道了150例肝癌患者術后細胞治療的臨床試驗結果，治療無明顯不良反應，治療組復發率較對照組下降18%，表明這一治療方法能夠降低術后肝癌患者的復發率，延長術后無復發的生存時間。

4.2 與微創治療的聯合應用

肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）因其在不可切除肝癌的治療中展現出的良好收益，目前被公認為中晚期肝癌的首選治療手段。但TACE治療后的復發率以及長期生存率仍不容樂觀。TACE后加以CIK細胞治療，不僅可以顯著提高其治療效果，還可以減輕化療藥物對肝臟的毒性作用，提高患者的免疫力，減少復發，延長無進展生存和總生存期[23]。射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）和TACE的聯合應用與單獨使用相比，可以促進腫瘤壞死并提高生存率[24]。國內一項回顧性研究對比了TACE及RFA聯合CIK細胞治療和傳統TACE聯合RFA治療在短期效果、生存率以及安全性等方面的差別。該研究認為從預防腫瘤復發、轉移以及改善患者預后提高生存治療方面來看，微創治療（TACE+RFA）聯合CIK治療比單獨微創治療更有價值[25]。最近還有關于CIK治療與局部射頻高溫治療（local radio frequency hyperthermia）相結合研究報道。局部射頻高溫治療通過物理能量產生的熱量能不僅能破壞線粒體、溶酶體、內質網的膜性結構，還可以刺激溶酶體釋放酸性水解酶最終導致癌細胞的壞死[26]，同時該治療方式不僅可以使細胞生長正常化同時還能阻止非正常的細胞分裂[27]。最新研究[28]認為經腹膜輸注CIK細胞后加以療法不僅可以通過物理方式消除腫瘤細胞，還能促進CIK細胞與腫瘤細胞的結合從而提高CIK細胞的反應率，同時局部射頻高溫還可以增加腫瘤細胞的敏感性，這也使得CIK細胞能夠更有效的對腫瘤細胞進行滲透。

4.3 與靶向藥物聯合應用

目前為止關于CIK細胞和靶向作用藥物聯合應用的研究報道數量并不多，其中最早的一個實驗是由Flieger等所開展。該實驗結果體現了CIK細胞與雙種特異性單鏈抗體的聯用在直接對抗上皮細胞黏附分子（EpCAM）/CD3的優越性。此后在關于CIK免疫治療和靶向藥物聯用的效果評價方面也未能取得重大突破。

索拉菲尼（sorafenib）是一種多酶抑制靶向抗腫瘤藥物。它不僅能通過RAF/MEK/ERK信號通路直接抑制腫瘤生長，同時還可以抑制VEGFR和PDGFR進而阻斷腫瘤血管新生，間接抑制瘤體生長。最近一項實驗研究了共同培養的DC-CIK細胞和索拉菲尼聯用在體內外對抗BEL27402肝細胞癌的抗腫瘤效應。DC-CIK細胞聯用索拉菲尼在肝癌細胞中產生的細胞毒活性比率[（72.24±2.42）%]明顯高于DC-CIK細胞（1.8倍）、索拉菲尼（2.1倍）以及CIK細胞（1.6倍）的單獨使用（P＜0.01）。同時，二者聯用所致BEL-7402細胞凋亡比率也明顯比索拉菲尼或者DC-CIK細胞單獨使用要高[（77.36±1.92）%；P＜0.05）]。李建旺等[29]的臨床觀察結果表明CIK-DC細胞聯合索拉菲尼治療晚期肝癌可使患者癥狀（疲乏無力、失眠、食欲不振等）明顯改善，索拉菲尼副反應減輕，顯示對不宜進行手術或化療晚期的肝癌患者具有改善癥狀、提高生活質量的作用。

5 展 望

肝癌的生物免疫治療是近年來出現的一種新興的治療方式，它不僅能清除體內殘存的癌癥細胞，同時還能促進機體自身的免疫功能恢復從對抗并消除疾病。雖然發展時間不長，但過繼免疫治療已在肝癌的治療中展現出了巨大的潛力。在肝癌患者的綜合治療中，CIK細胞治療起著延長生存期、減緩復發轉移等作用，但目前仍缺乏前瞻性研究以及大規模隨機對照試驗以及高質量的meta分析去支持其作為繼手術、放化療之后的一種有實際臨床效果的治療手段。從文獻報道看，不同單位在CIK細胞的制備方案和輸注存在差異。另外，CIK細胞治療的臨床效果的評價標準在不同單位也不完全相同，由此導致其實際臨床效果很難得到準確評估。隨著生物免疫作用機制研究的進一步深入及其臨床應用的不斷規范，以CIK細胞為主的過繼免疫治療必將在肝癌的治療中產生新的突破。

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Research Advances on CIK Cells’ Clinical Therapy in Liver Cancer

TAN Zhi-yong1, HUANG Jie1, GONG Jian-ping2*
(1 Department of Surgery, Yunyang Hospital, Chongqing 404500, China; 2 Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Second Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China)

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common histological type of liver cancer and the third most common cause of malignancy worldwide. Surgery, transcatheter arterial chemoembolization (transcatheter arterial chemoembolization, TACE) and radiofrequency ablation (radiofrequency ablation, RFA) are considered as the main treatments for HCC today. However, the recurrence rate is still high, and long-term survival is unsatisfactory. Due to the huge potential demonstrated by immune cells in treating malignant tumors, adoptive immunotherapy has become an important research direction in recent years. Cytokine induced killer cells (CIK) are raising concerns because of their unique features in tumor immunotherapy. This paper is aimed to introduce the basic characteristics of CIK cells and summarize research progresses on CIK cells’ clinical therapy in liver cancer.

Adoptive immunotherapy; Cytokine induced killer cells; Hepatocellular carcinoma

R735.7

A

1671-8194（2014）19-0099-04

*通迅作者：Email：gongjianping11@126.com