磁性氧化鐵納米粒子的表面修飾及其在CTCs分離中應用的研究進展*

黃小林 綜述 許恒毅 審校

隨著納米科學與技術的發展，納米粒子在不同研究領域已被廣泛應用。MIONs因具有高矯頑力、高磁敏性、非免疫原性、低毒性、較好的生物相容性等優勢，受到越來越多研究者的親睞［1-2］。由于MIONs在藥物轉運［3］、磁成像［4-5］、組織修復［6］、糖尿病治療［7］、癌癥治療［8-9］及CTCs分離檢測［10-13］等生物醫學領域具有潛在應用前景，引起了各相關領域研究者的關注。一般方法合成的MIONs水溶性和生物相容性較差、易團聚且在血液循環中存在時間較短，往往無法直接滿足生物醫學應用的要求［14］。因此，MIONs表面常需進行修飾和改性，以獲得更好的性能并引入合適的反應功能基團（如羧基、羥基等）。在此基礎上，引入多種生物相關分子（抗體、靶向劑、藥物分子及熒光素等），實現MIONs的功能化。本文對MIONs的表面修飾及其在CTCs分離中的應用進行綜述。

1 MIONs的表面修飾

MIONs粒徑一般在1～100 nm，絕大部分原子位于粒子的表面。疏水表面及比表面積較大因而具有特殊的表面性質：1）NPs（nanoparticles）處于高能狀態，且表面吉布斯自由能較大，可自發地團聚、氧化或表面吸附，以降低能量；2）NPs表面存在許多活性中心，具有較高的化學活性；3）NPs表面臺階和粗糙度增加，表面出現非化學平衡、非整數配位的化學價。通常可對MIONs進行表面修飾及改性，達到生物醫學應用的要求。

1.1 MIONs表面修飾的方法

MIONs的表面修飾方法主要有原位反應法（制備中修飾）和合成后表面改性法（制備后修飾）［15-16］。原位反應法是指在納米粒子制備過程中直接加入表面修飾劑共同反應，而合成后表面改性法是先制備出納米粒子，然后將其分散于表面修飾劑中進行包覆反應。

1.2 MIONs表面修飾劑的種類及作用

用于MIONs表面修飾的材料有很多，主要包括聚合物、非聚合物和無機分子［15-16］。使用聚合物修飾可以提高MIONs生物相容性和膠體穩定性，并引入反應基團，常見的聚合物有聚乙二醇和聚乙烯醇等。使用非聚合物修飾MIONs可提高膠體分散性，常見為有機小分子和表面活性劑分子等。使用無機分子修飾可提高MIONs在液體中的穩定性和抗氧化能力，且有利于生物配體的偶聯，常見的無機修飾分子有二氧化硅、金、金屬氧化物和硫化物等。

2 MIONs在CTCs分離中的應用

CTCs是一類主要存在于癌癥患者外周血循環中的腫瘤源性上皮細胞，可能與腫瘤的轉移和復發有關［17］。外周血中CTCs的出現往往早于臨床上可見實體瘤［18］。因此CTCs的精準診斷對于腫瘤的早期發現、腫瘤患者化療藥物的快速評估、個體化治療（臨床篩藥、耐藥性的檢測）、腫瘤復發的監測以及腫瘤新藥物的開發等具有重要的指導意義，同時可為癌癥的有效防治提供理論參考。但是，早期腫瘤患者外周血中CTCs的數量十分稀少，在人體正常血液中，每數億個（4.0～5.5）×109/mL紅細胞中僅含（0～50）個CTCs，加上血液的性質特殊（如粘稠、組分復雜等），導致CTCs完全“隱蔽”在外周血的復雜背景中，常規的手段還無法對其進行直接檢測［19-20］。目前CTCs的分離方法主要是基于細胞形態或細胞表面抗原/受體分子，已商業化的以免疫磁分離法應用最為廣泛。

2.1 CellSearchTM系統

CellSearchTM系統由美國Veridex公司研發，是目前唯一通過美國FDA認證的半自動CTCs檢測系統。該系統采用的免疫磁珠是含單個納米鐵磁核，且包被了抗上皮細胞黏附因子（EpCAM）特異性抗體的納米磁顆粒，可特異性結合血液中所有表達Ep-CAM的CTCs，并在外加強力磁場下將CTCs從血液樣本中分離出來。臨床應用CellSearchTM系統時，只需采集 7.5 mL 的血液樣本。Riethdorf等［21］利用 Cell-SearchTM檢測系統對92個轉移性乳腺癌患者外周血樣本（7.5 mL）中的CTCs進行分離檢測，結果發現63個樣本中至少含有1個CTCs，而另外的29個樣本中未檢測到CTCs。在含CTCs的63個樣本中，34個樣本CTCs的數量在5個以上（CTCs cut-off值≥5 CTCs時與預后相關），13個樣本CTCs數量在50個以上（最多為1 491 CTCs）。

2.2 激活細胞分選系統

激活細胞分選系統（magnetic activated cell sorting system，MACS?）是由德國Miltenyi公司研發的利用MACS微珠捕獲細胞的專用產品，該產品因操作簡便、快速（2.5～30 min）、高純度（90%～99%）、高回收率等優點已被廣泛應用于CTCs的分離。MACS微珠由氧化鐵組成且表面修飾了多聚糖。K?nigsberg等［22］使用MACS?正向選擇性分離轉移性乳腺癌患者外周血中EpCAM陽性CTCs，證明EpCAM陽性細胞（MCF-7及ZR-75-1）的回收率明顯高于EpCAM陰性細胞（Hs587T）。26個臨床確診為轉移性乳腺癌患者外周血樣本中，發現含CTCs的概率為42.3%。同時該研究將MACS?與另外一種不依賴于EpCAM密度離心分離法OncoQuick?plus進行對比分析，結果發現在分離EpCAM陽性細胞時前者的回收率明顯高于后者，相反在分離EpCAM陰性細胞時后者的回收率高于前者。

2.3 AdnaTestTM系統

AdnaTestTM是由德國AdnaGen AG公司開發用來分離和檢測血液中CTCs的系統。AdnaTestTM系統使用磁性微球來分離患者外周血樣本中表達有相關抗原的CTCs，基于RT-PCR技術檢測表達有相關特異性基因的腫瘤細胞。該磁性微球表面修飾了抗上皮抗原的抗體（抗EpCAM抗體）和抗腫瘤相關抗原的抗體（抗MUC1抗體）。相對CellSearchTM系統（需7.5 mL血液樣本），臨床應用AdnaTestTM系統時，只需采集5 mL血液樣本。Andreopoulou等［23］同時使用AdnaTestTM與美國Veridex公司研發的CellSearchTM對55個轉移性乳腺癌患者的外周血樣本進行檢測，結果發現CellSearchTM的CTCs陽性率為47%（CTCs cutoff值≥2 CTCs）和36%（CTCs cutoff值≥5 CTCs）；而AdnaTestTM的CTCs陽性率為53%。上述兩種檢測系統的陽性一致率為73%（CTCs cutoff值≥2 CTCs）和69%（CTCs cutoff值≥5 CTCs）。

2.4 Dynal Magnetic Beads?材料

Dynal Magnetic Beads?是由美國Invitrogen公司生產，用于細胞分離的免疫磁分離類產品，已取得美國環保局和美國分析化學家協會（AOAC）的認證。Dynal Magnetic Beads?由γ-Fe2O3和Fe3O4磁性材料合成，是一種超順磁、單分散性多聚微球，其表面修飾有一層用于吸附和結合生物活性分子的多聚材料。Dynal Magnetic Beads?用于細胞分離主要有以下優點：1）全部過程可在試管內完成，不需要磁柱及離心操作；2）可根據實驗需要選擇不同的分離方法；3）獲取的目標物質純度及產量較高；4）對后續分析無抑制作用而不需洗脫。Talasaz等［24］將1 000 CEpCs（circulating epithelial cells）加標于9 mL PBS溶液中，通過Dynal Magnetic Beads?選擇性捕獲1 h后使用分離器分離，CEpCs的分離效率達50%。該研究對52個外周血樣本（9 mL）又進行分離，發現在健康者的樣本中并未分離到CEpCs，而47個轉移性乳腺癌患者外周血樣本均檢測到CEpCs，其數量為（12±23）個。

2.5 EasySep?技術

EasySep?是由加拿大StemCell公司開發的一種新型而高效的免疫磁珠細胞分選技術。EasySep?的理論基礎為靶細胞表面特異性的抗原抗體反應，其實現靶細胞高純度分離則基于StemCell公司四聚體復合物（TAC）技術。需要富集的靶細胞通過TAC與磁微粒相結合后在EasySep?專用磁極提供的磁場中即可與非靶細胞相分離。EasySep?所用的磁微粒極小，不會影響靶細胞的后續分析，因此不需要去除，具有簡單快捷（25 min）、獲得細胞純度高（達99%）、回收率高、對細胞無影響等優點。Fusi等［25］應用EasySep?分離了68個腫瘤患者外周血樣本（10 mL）中的CTCs，結果顯示72%（49/68）的樣本至少分離到1個CTCs。

2.6 基于磁性納米粒子的其他分離方法

隨著新型納米材料和表面修飾材料的不斷出現，越來越多基于納米粒子的磁分離方法被建立并用于CTCs的分離。如Xu等［11］利用熱分解法在有機溶劑十八烯中，以氧化鐵粉為前體、油酸為配體，成功制備了表面修飾有雙親聚合物的MIONs。該MIONs直徑為30 nm，具有良好的生物相容性且可利用其表面的羧基來偶聯癌細胞相關抗體。該研究將MIONs表面的羧基與抗HER-2抗體上的氨基偶聯并用于外周血中癌細胞的分離，可以分離出平均73.6%的SK-BR-3細胞（最大為84%）。

3 結語與展望

20世紀70年代以來，MIONs已受到國內外學者的普遍關注，有關其制備、表面修飾或改性及應用的研究論文層出不窮。MIONs作為一種磁性強、制備相對簡單、且生物相容性較好的磁性納米材料，已被廣泛應用于各種生物醫學領域。在CTCs的分離和腫瘤的治療方面，MIONs起著至關重要的作用，具有極大的發展空間和應用前景。為此，除了MIONs自身合成需不斷改進外，MIONs的表面修飾或改性的完善也是未來研究的重點。相信隨著高分子材料學、磁學、醫學、生物工程學的進一步發展，MIONs相關的基礎研究和應用研究必將也加速發展，從而為臨床上CTCs的分離檢測和腫瘤的早期診斷及治療提供新的契機。

1 Wu W,He Q,Jiang C.Magnetic iron oxide nanoparticles:synthesis and surface functionalization strategies[J].Nanoscale Res Lett,2008,3(11):397-415.

2 Tong L,Zhao M,Zhu S,et al.Synthesis and application of superparamagnetic iron oxide nanoparticles in targeted therapy and imaging of cancer[J].Front Med,2011,5(4):379-387.

3 Chertok B,Moffat BA,David AE,et al.Iron oxide nanoparticles as a drug delivery vehicle for MRI monitored magnetic targeting of brain tumors[J].Biomaterials,2008,29(4):487-496.

4 Jain TK,Richey J,Strand M,et al.Magnetic nanoparticles with dual functional properties:drug delivery and magnetic resonance imaging[J].Biomaterials,2008,29(29):4012-4021.

5 Hu LJ,Guan WX.Advance in ultra small super paramagnetic iron exrde particles in target MRI contrast agents[J].Chin J Cliu Oncol,2013,40(7):423-426.[胡立江,管文賢.超小超順磁性氧化鐵粒子的靶向磁共振顯影劑研究進展[J].中國腫瘤臨床,2013,40(7):423-426.］

6 Raju HB,Goldberg JL.Nanotechnology for ocular therapeutics and tissue repair[J].Expert Rev Ophthalmol,2008,3(4):431-436.

7 Chen B,Wu W,Wang X.Magnetic iron oxide nanoparticles for tumor-targeted therapy[J].Curr Cancer Drug Targets,2011,11(2):184-189.

8 Xu Y,Karmakar A,Heberlein WE,et al.Multifunctional magnetic nanoparticles for synergistic enhancement of cancer treatment by combinatorial radio frequency thermolysis and drug delivery[J].Adv Healthc Mater,2012,1(4):493-501.

9 Sadhukha T,Wiedmann TS,Panyam J.Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy[J].Biomaterials,2013,34(21):5163-5171.

10 Galanzha EI,Shashkov EV,Kelly T,et al.In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells[J].Nat Nanotechnol,2009,4(12):855-860.

11 Xu H,Aguilar ZP,Yang L,et al.Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood[J].Biomaterials,2011,32(36):9758-9765.

12 Hossain M,Luo Y,Sun Z,et al.X-ray enabled detection and eradication of circulating tumor cells with nanoparticles[J].Biosens Bioelectron,2012,38(1):348-354.

13 Chen P,Li L.Advances in detection of circulating tumor Cells in non small cell lung cancer[J].Chin J Clin Oncol,2013,40(14):862-865［.陳 鵬,李 雷.非小細胞肺癌循環腫瘤細胞檢測進展[J].中國腫瘤臨床,2013,40(14):862-865.］

14 Gupta AK,Curtis AS.Surface modified superparamagnetic nanoparticles for drug delivery:interaction studies with human fibroblasts in culture[J].J Mater Sci Mater Med,2004,15(4):493-496.

15 Mahmoudi M,Simchi A,Imani M.Recent advances in surface engineering of superpara-magnetic iron oxide nanoparticles for biomedical applications[J].J Iran Chem Soc,2010,7(Suppl):S1-S27.

16 Mahmoudi M,Sant S,Wang B,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs):development,surface modification and applications in chemotherapy[J].Adv Drug Deliv Rev,2011,63(1-2):24-46.

17 Mocellin S,Keilholz U,Rossi CR,et al.Circulating tumor cells:the'leukemic phase'of solid cancers[J].Trends Mol Med,2006,12(3):130-139.

18 Molnar B,Ladanyi A,Tanko L,et al.Circulating tumor cell clusters in the peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Clin Cancer Res,2001,7(12):4080-4085.

19 Nagrath S,Sequist LV,Maheswaran S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

20 Hosokawa M,Hayata T,Fukuda Y,et al.Size-selective microcavity array for rapid and efficient detection of circulating tumor cells[J].Anal Chem,2010,82(15):6629-6635.

21 Riethdorf S,Fritsche H,Müller V,et al.Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer:a validation study of the CellSearch system[J].Clin Cancer Res,2007,13(3):920-928.

22 K?nigsberg R,Obermayr E,Bises G,et al.Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients[J].Acta Oncol,2011,50(5):700-710.

23 Andreopoulou E,Yang LY,Rangel KM,et al.Comparison of assay methods for detection of circulating tumor cells in metastatic breast cancer:AdnaGen AdnaTest Breast Cancer Select/DetectTMversus Veridex CellSearchTMsystem[J].Int.J Cancer,2012,130(7):1590-1597.

24 Talasaz AH,Powell AA,Huber DE,et al.Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(10):3970-3975.

25 Fusi A,Liu Z,Kümmerlen V,et al.Expression of chemokine receptors on circulating tumor cells in patients with solid tumors[J].J Transl Med,2012,10:52.