細(xì)胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)*

詹啟敏 陳 杰

惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞失控性增殖，而細(xì)胞失控性增殖的生物學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂。細(xì)胞周期調(diào)控是一個(gè)精細(xì)的生物學(xué)過(guò)程，涉及了多個(gè)基因和蛋白的參與，進(jìn)而形成了復(fù)雜的信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，了解細(xì)胞周期及其相關(guān)基因的表達(dá)可以從基礎(chǔ)生物學(xué)研究的角度深入發(fā)掘腫瘤的本質(zhì)，闡明癌癥的發(fā)生機(jī)制，并為腫瘤的早期診斷提供標(biāo)記分子。此外，細(xì)胞周期蛋白的深入研究還能夠?yàn)樵O(shè)計(jì)特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物和發(fā)展個(gè)體化的臨床治療方案提供理論基礎(chǔ)，為選擇特異性藥物靶點(diǎn)、優(yōu)化治療措施提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 細(xì)胞周期相關(guān)基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及意義

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，許多抑癌基因如 p53、BRCA1、Rb、p16、p15 以及 p53、BRCA1的下游調(diào)控基因如p21、Gadd45是細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)的重要組成部分。但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，這些抑癌基因多有基因改變而失活，造成細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能缺陷。

監(jiān)測(cè)點(diǎn)的功能缺陷將導(dǎo)致各種錯(cuò)誤被帶入細(xì)胞周期，例如DNA復(fù)制錯(cuò)誤和染色體分離紊亂等，并造成基因組的不穩(wěn)定性。基因組的不穩(wěn)定性通常表現(xiàn)為基因突變、基因缺失，基因重排和易位，以及中心體擴(kuò)增和染色體畸形。基因組不穩(wěn)定性將導(dǎo)致基因組紊亂程度進(jìn)一步惡化，其結(jié)果是細(xì)胞周期制動(dòng)機(jī)制（監(jiān)控機(jī)制）失活并伴隨細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制強(qiáng)化，從而產(chǎn)生細(xì)胞失控性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。所以，腫瘤發(fā)生的重要原因是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞。

2 癌相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中的生物學(xué)作用

腫瘤抑癌基因p53和BRCA1在細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。本課題組與其他研究團(tuán)隊(duì)研究顯示，p53和BRCA1的最重要生物學(xué)功能之一是參與細(xì)胞周期調(diào)控。p53和BRCA1功能的紊亂導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的失控，進(jìn)而造成基因組的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成和惡性增殖。p53和BRCA1蛋白是轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)許多基因表達(dá)，通過(guò)下游基因，參與細(xì)胞周期的調(diào)控［1］。p53在細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的多個(gè)環(huán)節(jié)起到重要作用，當(dāng)某個(gè)細(xì)胞的染色體DNA在G1期受到損傷時(shí)，p53轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)p21基因的激活，進(jìn)而使p21抑制細(xì)胞周期依賴激酶（CDK）的活性，阻止細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。而當(dāng)損傷信號(hào)進(jìn)入S期時(shí)，由p53誘導(dǎo)的p21可在復(fù)制叉處連接DNA聚合酶復(fù)合體，并阻止其活性，誘導(dǎo)細(xì)胞的修復(fù)。此外，p53還能通過(guò)誘導(dǎo)其他基因和蛋白的活性來(lái)加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，如14-3-3σ等。如果染色體DNA的損傷過(guò)于嚴(yán)重，p53就會(huì)啟動(dòng)凋亡。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物Rb是一個(gè)重要的抑癌基因。Rb與Cyclin D、CDK4及p16等分子相互作用，抑制細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)。在腫瘤細(xì)胞中，Rb基因缺失，導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。此外，Rb也參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，其磷酸化程度與細(xì)胞周期的進(jìn)程一致。當(dāng)G1期起始時(shí)，Cyclin D/CDK4復(fù)合體形成，Rb起始磷酸化，磷酸化的Rb釋放與其結(jié)合并抑制的蛋白，如E2F家族成員。E2F刺激了包括Cyclin E在內(nèi)的G1/S期基因的表達(dá)，這些分子促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S期監(jiān)測(cè)點(diǎn)，使細(xì)胞周期進(jìn)入S期。但當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷，高表達(dá)的p21抑制Cyclin D/CDK4對(duì)Rb的磷酸化，使Rb處于去磷酸化狀態(tài)，其結(jié)合E2F家族成員，阻止了E2F調(diào)控的G1/S期基因表達(dá)，細(xì)胞阻滯在G1期（G1/S期監(jiān)測(cè)點(diǎn)）。Gadd45亦在DNA損傷時(shí)細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)的調(diào)控、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要的作用。

2.1 Gadd45在腫瘤細(xì)胞周期中的生物學(xué)作用及意義

Gadd45表達(dá)通過(guò)BRCA1和p53的影響，進(jìn)而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。近年來(lái)本課題組著重研究了p53/Gadd45通路和BRCA1/Gadd45通路在調(diào)控細(xì)胞周期G2/M監(jiān)測(cè)點(diǎn)和中心體（centrosome）復(fù)制中的分子機(jī)制，以揭示細(xì)胞增殖失調(diào)與腫瘤惡性生長(zhǎng)的內(nèi)在聯(lián)系。其機(jī)制主要有以下4點(diǎn)：1）Gadd45是在細(xì)胞DNA受到損傷或細(xì)胞接受生長(zhǎng)阻滯信號(hào)時(shí)被誘導(dǎo)的一種基因，也是在世界上首次報(bào)道的P53蛋白調(diào)控的靶基因［2］。研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45蛋白依賴于正常p53分子的功能，進(jìn)而在細(xì)胞周期G2/M監(jiān)測(cè)點(diǎn)調(diào)控中發(fā)揮重大作用。近一步的研究表明，Gadd45通過(guò)與Cdc2激酶相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致Cdc2/Cyclin B1復(fù)合物解離并改變Cyclin B1的亞細(xì)胞定位，從而抑制Cdc2激酶的活性，形成細(xì)胞周期G2/M期介導(dǎo)的生長(zhǎng)阻滯（即G2/M監(jiān)測(cè)點(diǎn)）［3］。此外，激活的Gadd45蛋白通過(guò)ERK信號(hào)通路反饋性誘導(dǎo)P53蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)。2）探討了Gadd45蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程及其相關(guān)的機(jī)制。Gadd45是一種無(wú)核定位信號(hào)（nuclear localization signal）的核蛋白，可能是通過(guò)一種特殊的核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被其他載體蛋白帶入核內(nèi)。目前的研究顯示，這種載體蛋白（分子伴侶蛋白）可能是核仁磷酸蛋白B23/NPM［4］。3）Gadd45 和中心體復(fù)制相關(guān)的激酶 Aurora-A有直接的相互作用。由于Aurora-A激酶的過(guò)度激活可以導(dǎo)致中心體擴(kuò)增和染色體畸形，推斷并證明Gadd45在維持中心體穩(wěn)定性的生物學(xué)功能是通過(guò)抑制Aurora-A激酶的活性來(lái)體現(xiàn)的［5］。4）分析BRCA1調(diào)控Gadd45基因的分子生物學(xué)機(jī)制。證明BRCA1對(duì)Gadd45的調(diào)控是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平，BRCA1調(diào)控Gadd45基因的活性位點(diǎn)是在Gadd45的啟動(dòng)子上［6］。但p53對(duì)Gadd45基因的調(diào)控是通過(guò)直接結(jié)合Gadd45第3個(gè)內(nèi)含子來(lái)進(jìn)行的。由于BRCA1目前還不能被證實(shí)是一個(gè)能夠結(jié)合特異DNA位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，本課題組研究發(fā)現(xiàn)BRCA1對(duì)Gadd45基因的調(diào)控是通過(guò)2個(gè)可與Gadd45啟動(dòng)子直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1和NF-YA相互作用而體現(xiàn)的。這項(xiàng)研究工作極大地拓寬了BRCA1在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的生物學(xué)功能［7］。

2.2 Nlp在腫瘤細(xì)胞周期中的生物學(xué)作用及意義

本課題組研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與BRCA1有直接相互作用且共定位于中心體的新蛋白Nlp（ninein like protein）。Nlp在中心體的定位以及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可能依賴于BRCA1的正常功能，突變的BRCA1或沉默內(nèi)源性BRCA1均會(huì)破壞其在中心體的共定位關(guān)系以及Nlp的降解。抑制內(nèi)源的Nlp會(huì)導(dǎo)致異常紡錘體的形成、染色體分離失敗、胞質(zhì)分裂失敗以及染色體的非整倍性［8-9］。

人乳腺癌和肺癌中研究顯示，Nlp過(guò)表達(dá)可能與Nlp基因的擴(kuò)增有關(guān)。Nlp表現(xiàn)出較強(qiáng)的癌基因特性，可以轉(zhuǎn)化NIH3T3成纖維細(xì)胞。更有重要意義的是Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠的表型與缺失BRCA1正常功能的表型相似，包括中心體擴(kuò)增和自發(fā)腫瘤［10］。可見，Nlp可能是BRCA1調(diào)控細(xì)胞分裂的重要蛋白分子，在有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮作用，Nlp的異常可以導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和腫瘤發(fā)生。本課題組最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nlp的異常高表達(dá)明顯降低紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，直接影響到臨床乳腺癌患者的療效［11］。

3 細(xì)胞周期分子與臨床診斷及腫瘤治療

細(xì)胞周期調(diào)控的正常進(jìn)行以及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，鑒定參與調(diào)控細(xì)胞周期各個(gè)環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)群并且評(píng)價(jià)這些蛋白質(zhì)群在調(diào)控細(xì)胞周期的各個(gè)階段、維持基因組穩(wěn)定性中的作用機(jī)制以及蛋白質(zhì)群之間的相互作用對(duì)于腫瘤研究至關(guān)重要。其中，Cyclins和CDKs所構(gòu)成的細(xì)胞周期時(shí)鐘復(fù)合體以及其相應(yīng)的抑制分子CKIs（cyclin kinase inhibitor）功能的紊亂在多種腫瘤被發(fā)現(xiàn)，因此了解Cyclins/CDKs/CKIs軸在各型腫瘤中的表達(dá)及研究其相應(yīng)的生物學(xué)功能對(duì)于臨床早期診斷惡性腫瘤和有效防治腫瘤具有重大的意義和價(jià)值。

3.1 Cyclin B1與腫瘤預(yù)后判斷、個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)及相應(yīng)的基礎(chǔ)研究

Cyclin B1蛋白在細(xì)胞周期中呈時(shí)相性表達(dá)，在G2/M期時(shí)表達(dá)達(dá)到峰值，并與CDK1結(jié)合形成復(fù)合體，啟動(dòng)有絲分裂，進(jìn)而誘導(dǎo)G2/M期的轉(zhuǎn)變。Cyclin B1表達(dá)的紊亂能夠?qū)е录?xì)胞周期運(yùn)行的失控及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤中，如食管鱗癌、肺癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、直腸癌、肝癌、腎癌及胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)了Cyclin B1的過(guò)表達(dá)。Cyclin B1過(guò)表達(dá)的機(jī)制可能與原癌基因c-myc、H-Ras等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，mRNA穩(wěn)定性增加及p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)。Cyclin B1過(guò)表達(dá)可作為腫瘤惡性進(jìn)展的指征，對(duì)判斷多種鱗狀細(xì)胞癌，如食管鱗癌、肺鱗癌和舌癌等患者預(yù)后及生存率有著重要的意義。利用反義寡核苷酸等方法特異性地抑制多種腫瘤細(xì)胞中Cyclin B1基因的表達(dá)，能夠顯著地抑制這些腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，說(shuō)明Cyclin B1作為臨床腫瘤治療靶點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值。此外，乳腺癌患者中BRCA1基因缺陷時(shí)常伴有Cyclin B1/CDK1復(fù)合體功能亢進(jìn)。因此，在乳腺癌的治療過(guò)程中，除了判斷BRCA1基因的缺失與否，檢測(cè)Cyclin B1的表達(dá)情況對(duì)乳腺癌的個(gè)性化治療起到了重要的作用。雖然大量臨床研究顯示了Cyclin B1與腫瘤的關(guān)聯(lián)性，但是對(duì)于Cyclin B1誘導(dǎo)腫瘤惡性進(jìn)展的機(jī)制卻知之甚少。本課題組研究首次證實(shí)了Cyclin B1在腫瘤細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向特定器官轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Cyclin B1能夠?qū)е录?xì)胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，特別是透過(guò)微血管內(nèi)皮向肺組織侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。抑制食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Cyclin B1能夠顯著抑制食管鱗癌的生長(zhǎng)和對(duì)肺組織的靶向性轉(zhuǎn)移。其分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin B1誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)與激活NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)［12］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Cyclin B1能夠通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，參與食管鱗癌化療藥耐藥的產(chǎn)生，進(jìn)一步證實(shí)了Cyclin B1作為腫瘤治療藥物靶點(diǎn)的重要意義［13］。

3.2 Aurora-A與腫瘤預(yù)后判斷、個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)及相應(yīng)的基礎(chǔ)研究

Aurora激酶家族分為3個(gè)成員：Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C，主要調(diào)節(jié)中心體和微管的功能。其中Aurora-A在G2/M期轉(zhuǎn)變、中心體分離、紡錘體裝配以及胞質(zhì)分裂中扮演了重要的角色。在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌，肝癌、胰腺癌、食管鱗癌及胃癌等臨床研究中Aurora-A均過(guò)表達(dá)。Aurora-A過(guò)表達(dá)的機(jī)制可能與其基因組擴(kuò)增，進(jìn)而導(dǎo)致中心體異常以及p53分子的突變及Aurora-A本身在腫瘤組織中存在的基因多態(tài)性有關(guān)。在胃癌、結(jié)腸癌及頭頸腫瘤等臨床研究中Aurora-A的基因拷貝數(shù)均過(guò)度增加。Aurora-A的基因多態(tài)性能夠誘導(dǎo)其激酶活性的增強(qiáng)，更易出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞，并與絕經(jīng)后婦女患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性呈正相關(guān)［14］。Aurora-A基因與蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)明顯高于鄰近正常組織，并且其表達(dá)情況與TMN分級(jí)、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和家族史等都存在明顯的相關(guān)性［15］。進(jìn)一步研究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Aurora-A在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)程度與其DNA拷貝數(shù)有關(guān)［16］。針對(duì)此機(jī)制，在非小細(xì)胞肺癌中通過(guò)Aurora-A特異性抑制劑能夠抑制多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的惡性生長(zhǎng)。此外，Aurora-A的蛋白表達(dá)量與腎母細(xì)胞瘤的臨床分期關(guān)系密切，針對(duì)Aurora-A活性的抑制劑在臨床前期腎母細(xì)胞瘤的治療過(guò)程中顯示了良好的應(yīng)用前景。基于這些認(rèn)識(shí)，開發(fā)Aurora-A的特異性抑制劑能夠?yàn)槟[瘤個(gè)性化治療提供一種新的策略。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A能夠與抑癌基因AP-2α相互結(jié)合，進(jìn)而降低AP-2α的穩(wěn)定性并通過(guò)蛋白酶體促進(jìn)其降解，進(jìn)一步豐富了Aurora-A在誘導(dǎo)腫瘤發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制［17］。研究還發(fā)現(xiàn)，Aurora-A過(guò)表達(dá)能夠提高食管鱗癌細(xì)胞的增殖、黏附及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并增強(qiáng)裸鼠的致瘤能力和對(duì)周圍組織的侵襲能力，與食管鱗癌的臨床病理分級(jí)存在明顯的相關(guān)性。利用siRNA干擾Aurora-A的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，抑制Aurora-A表達(dá)能夠使食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力顯著降低。從另一個(gè)角度發(fā)現(xiàn)了Aurora-A在食管鱗癌中的促腫瘤功能并證實(shí)Aurora-A作為食管鱗癌預(yù)后判斷的獨(dú)立因素和抗腫瘤藥物靶點(diǎn)開發(fā)的潛在價(jià)值［18］。此外，還發(fā)現(xiàn)Aurora-A能夠誘導(dǎo)Bcl-2的活性，進(jìn)而產(chǎn)生化療藥耐藥性，進(jìn)一步豐富了Aurora-A的生物學(xué)功能和該蛋白的臨床應(yīng)用價(jià)值［19］。

3.3 Cyclin D與腫瘤預(yù)后判斷、個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)及相應(yīng)的基礎(chǔ)研究

Cyclin D家族分為3個(gè)亞型：Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3。其中Cyclin D1的研究最為廣泛，在正常組織中，Cyclin D1不表達(dá)或者表達(dá)較低，而在腫瘤組織中，Cyclin D1經(jīng)常出現(xiàn)基因擴(kuò)增，基因重排及突變，導(dǎo)致基因產(chǎn)物增多。在胃癌、乳腺癌、淋巴瘤、原發(fā)性肝癌等臨床研究中Cyclin D1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常組織。此外，抑制頭頸腫瘤及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)Cyclin D1的活性顯示了良好的腫瘤抑制作用。反義寡核苷酸Cyclin D1能夠抑制Cyclin D1的活性，進(jìn)而增強(qiáng)卡鉑在多種腫瘤中的生長(zhǎng)抑制效果，這些研究為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)［20-21］。

3.4 Cyclin E與腫瘤預(yù)后判斷及個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)

Cyclin E能夠控制細(xì)胞周期進(jìn)入S期，常被視為S期的標(biāo)志物，Cyclin E介導(dǎo)的G1/S期決定和限速作用在細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中起到中心調(diào)控作用。Cyclin E過(guò)表達(dá)主要由其基因擴(kuò)增所誘導(dǎo)，這些過(guò)表達(dá)的Cyclin E能夠形成大量畸形的中心體，有利于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤惡性增殖。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、膀胱癌及白血病等臨床研究中Cyclin E均過(guò)度表達(dá)。因此，Cyclin E在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的癌基因角色越來(lái)越被學(xué)者們認(rèn)同，在臨床上逐漸被作為一種獨(dú)立或者聯(lián)合指標(biāo)用來(lái)判斷疾病進(jìn)展程度和患者預(yù)后［22-24］。

3.5 p16與腫瘤預(yù)后判斷及個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)

p16基因又稱為多腫瘤抑制基因（multi-tumor suppressor gene，MTS1）。該基因定位于9號(hào)染色體短臂，主要抑制CDKs的活性，起到分子剎車的作用。在多種腫瘤中，如肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，p16基因出現(xiàn)較高頻率的功能缺失性突變。胃癌、肝癌及非小細(xì)胞肺癌等臨床研究中p16基因缺失。作為功能與p16相類似的抑癌基因p14也能夠起到細(xì)胞周期阻滯的作用。但是p14作用機(jī)制與p16不同，不與CDK激酶結(jié)合，主要通過(guò)誘導(dǎo)MDM2從核質(zhì)向核仁轉(zhuǎn)位，進(jìn)而使p53在核質(zhì)中積累導(dǎo)致p53的穩(wěn)定性增強(qiáng)［25-26］。在許多人類腫瘤細(xì)胞中，如肺癌、白血病、黑色素瘤及肝癌等細(xì)胞中p14基因均出現(xiàn)了缺失性突變。這種p14基因的缺失性突變也能夠被作為判斷腫瘤患者預(yù)后的臨床指征。通過(guò)腺病毒將p16基因?qū)敕伟⑷橄侔┘鞍螂装┘?xì)胞中，能夠造成細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為腫瘤的靶向基因治療提供了策略和思路。

3.6 p21與腫瘤預(yù)后判斷及個(gè)性化治療的關(guān)聯(lián)

p21是最先發(fā)現(xiàn)的CKI基因，定位于6號(hào)染色體短臂21.2。作為一種抑癌基因，p21通過(guò)與多個(gè)Cyclin/CDK復(fù)合體結(jié)合，進(jìn)而抑制其活性，在細(xì)胞周期的多個(gè)時(shí)相起到阻滯作用。此外，p21的C端還有增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合域，與PCNA結(jié)合后使之不能與DNA聚合酶形成復(fù)合物，阻止DNA全酶復(fù)合物在DNA單鏈上滑動(dòng)，抑制DNA復(fù)制。多種腫瘤中存在著p21的多態(tài)性突變，導(dǎo)致p21難以抑制Cyclin/CDK復(fù)合體的形成［27-28］。p27與p21有較高的同源性，亦能夠與多種Cyclin/CDK結(jié)合并抑制其活性。近年來(lái)，p27在腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤惡性增殖的關(guān)系受到廣泛重視，在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肺癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤中p27的表達(dá)水平下降［29-31］。因此，p21、p27基因的功能缺失性突變和多態(tài)性突變都能夠被用來(lái)作為判斷腫瘤患者預(yù)后。將外源性p21基因通過(guò)基因克隆的方法轉(zhuǎn)染入慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中能夠顯著抑制細(xì)胞的惡性增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.7 細(xì)胞周期分子與腫瘤治療

放療和化療是治療惡性腫瘤最重要的手段，但腫瘤細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生耐受及對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥常常最終導(dǎo)致放化療失敗。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)缺陷有可能是增加放化療治療效果的希望所在。細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)缺陷的腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射和某些抗癌藥物十分敏感。其機(jī)制是監(jiān)測(cè)點(diǎn)缺陷的腫瘤細(xì)胞在放射線和化療藥物引起DNA損傷后，不能正常行使監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能，細(xì)胞周期不能停滯，修復(fù)機(jī)制不被啟動(dòng)，而細(xì)胞周期強(qiáng)行通過(guò)時(shí)啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡機(jī)制，從而更容易使細(xì)胞死亡。基于此研究理論，目前開發(fā)的多種消除細(xì)胞周期G2監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能的藥物，如咖啡堿和UCN-01等，能增加放射線的治療作用。可見，細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)缺陷既是腫瘤發(fā)生的根本原因，又是研制特異性腫瘤治療的靶點(diǎn)。闡明細(xì)胞周期相關(guān)分子及其相應(yīng)機(jī)制可以為臨床腫瘤治療藥物和特異的治療方案提供理論基礎(chǔ)，達(dá)到有效治療惡性腫瘤的目的。

近年來(lái)，各種組學(xué)研究的迅速發(fā)展和生物信息學(xué)的利用使化療藥物作用機(jī)制等方面的研究獲得了突破性進(jìn)展。分析化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)與特定基因的表達(dá)和/或多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，選擇合適的藥物進(jìn)行個(gè)體化治療，已經(jīng)成為提高療效、減少無(wú)效治療的合理選擇。腫瘤組織中多種靶標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平可以用來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)多種常用化療藥物的反應(yīng)。此外，對(duì)于細(xì)胞周期相應(yīng)分子的基因表達(dá)情況及多態(tài)性研究也日益豐富。了解這些基因表達(dá)及多態(tài)性情況對(duì)選擇有針對(duì)性的藥物及其劑量，開展個(gè)性化治療，提高治療效果起到了重要的作用。

4 細(xì)胞周期分子與藥物設(shè)計(jì)

4.1 作用于細(xì)胞周期的抗腫瘤藥物

細(xì)胞周期的異常運(yùn)轉(zhuǎn)是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，其中S期的DNA合成和G2/M期的細(xì)胞有絲分裂對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的惡性增殖尤為重要。各種抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制大都體現(xiàn)在對(duì)于細(xì)胞周期這2個(gè)時(shí)相的調(diào)控上。因此，針對(duì)這2個(gè)時(shí)相以及相應(yīng)藥物的研究對(duì)于了解細(xì)胞周期和化療藥的相互關(guān)系起到重要的作用。1）作用于S期化療藥物主要有喜樹堿和氟尿嘧啶。喜樹堿作為從中國(guó)珙桐科植物喜樹中分離出來(lái)的化合物能夠通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）活性，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞阻滯在S期。喜樹堿在多種腫瘤，如小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、直腸癌、乳腺癌及皮膚癌等中具有抗腫瘤活性。氟尿嘧啶是一類廣譜的抗腫瘤藥物，在腫瘤細(xì)胞中氟尿嘧啶轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，并與還原型四氫葉酸及胸腺嘧啶核苷酸合成酶結(jié)合，使胸腺嘧啶核苷酸合成酶失活，進(jìn)而抑制S期的DNA合成，達(dá)到抗腫瘤的效果。2）作用于G2/M期化療藥物主要有紫杉醇和長(zhǎng)春新堿。紫杉醇作為臨床常用的化療藥能夠用來(lái)治療多種實(shí)體瘤，如肺癌、胃癌、肝癌、頭頸腫瘤、食管鱗癌等。通過(guò)破壞微管的聚合，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，導(dǎo)致Cyclin/CDK復(fù)合體，特別是Cyclin B1/CDK1復(fù)合體難以形成，最終阻止細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外，長(zhǎng)春新堿亦可通過(guò)作用于微管，抑制微管聚合進(jìn)而使細(xì)胞阻滯于G2/M期，進(jìn)而對(duì)多種腫瘤，如胃癌、肝癌、小細(xì)胞肺癌等起到殺傷作用。

4.2 基于Aurora-A、Cyclin B1及MDM2的化療藥物開發(fā)

基于大量前期研究并結(jié)合本課題組研究成果，Aurora-A、Cyclin B1及MDM2有望作為新型細(xì)胞周期分子靶點(diǎn)，用于化療藥物的開發(fā)。其中，Aurora-A靶向小分子化合物（MLN8054）能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aurora家族成員中ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制Aurora，特別是Aurora-A的激酶活性。其機(jī)制主要與MLN8054抑制Aurora-A T288位點(diǎn)的自磷酸化有關(guān)。此外，MLN8054誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用能夠在多種p53缺陷性的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生，進(jìn)一步說(shuō)明了MLN8054能夠不依賴于p53的作用抑制腫瘤生長(zhǎng)。PHA-680632作為與MLN8054功能相類似的小分子化合物，在臨床前實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)可用于多種腫瘤細(xì)胞系，并且其半數(shù)抑制率已達(dá)到nM級(jí)。此外，PHA-680632還能夠增敏放療在腫瘤治療過(guò)程中的效果，證實(shí)了PHA-680632能夠聯(lián)合其他抗腫瘤方案的療效。喹啉噻唑啉酮類化合物（RO-3306）能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK1中ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制Cyclin B1/CDK1復(fù)合體的功能，誘導(dǎo)G2/M期阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。MDM2通過(guò)與野生型p53相互拮抗，進(jìn)而起到癌基因的作用。通過(guò)分子對(duì)接及進(jìn)一步活性篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的一些抑制MDM2-p53結(jié)合的小分子化合物，如苯二氮平類、螺-吲哚酮類、Nutlin-3等均在臨床前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的腫瘤抑制效果。

4.3 天然產(chǎn)物及單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的作用

目前正在臨床應(yīng)用或者處于臨床前研究的多種抗腫瘤藥物，如一些天然產(chǎn)物及單克隆抗體等均具備了一定的細(xì)胞周期抑制作用。因此，研究這些藥物的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用，對(duì)于理解藥物的抗腫瘤藥理機(jī)制及效應(yīng)起到了重要的作用。其中多種生物堿類、黃酮類及萜類天然產(chǎn)物能夠作用于細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相，進(jìn)而起到抗腫瘤作用。如苦參堿能夠使肝癌細(xì)胞系和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系阻滯于S期，同時(shí)抑制端粒酶活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，從檳榔樹果中提取的檳榔堿能夠使口腔上皮癌細(xì)胞系阻滯于G2/M期，起到細(xì)胞毒作用。水飛薊素能夠通過(guò)提高CKIs，特別是p21的活性，進(jìn)而抑制Cyclin D/CDK4復(fù)合體的功能，使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1期。異黃酮類能夠在低劑量時(shí)使細(xì)胞阻滯于G2/M期，高劑量時(shí)使細(xì)胞阻滯于S期，進(jìn)而抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。萜類化合物棉子酚能夠使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S期，而多萜類及半萜類化合物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的G1期。

雖然目前無(wú)特異性針對(duì)細(xì)胞周期分子的單克隆抗體，但是多種酪氨酸激酶受體抑制劑能夠抑制各種生長(zhǎng)信號(hào)及激酶受體本身對(duì)下游促細(xì)胞周期分子特別是對(duì)CDKs的激活效應(yīng)，進(jìn)而間接地起到細(xì)胞周期阻滯作用。

4.4 基于CDKs的小分子化合物開發(fā)

當(dāng)前CDKs抑制劑開發(fā)的方向主要針對(duì)CDKs-ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的高度保守性，采用分子對(duì)接及相應(yīng)的高通量篩選等技術(shù)獲得小分子化療藥物。主要的CDKs小分子抑制劑主要分為以下3類：嘌呤衍生物、Flavopiridols及Paullones。1）嘌呤衍生物主要包括6-二甲基-氨基嘌呤、Isopentenyladenine、Olomoucine、Roscovitine及其衍生物等。其中，6-二甲基-氨基嘌呤是第1代CDKs抑制劑，其作用靶點(diǎn)為CDK1，但其作用特異性不高。第2代和第3代嘌呤的衍生物（Isopentenyladenine和 Olomoucine）對(duì)CDKs的作用強(qiáng)度及選擇性均較強(qiáng)，但是其半數(shù)抑制濃度仍停留在μM級(jí)。第4代衍生物Roscovitine是對(duì)Olomoucine進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造的產(chǎn)物，對(duì)CDK1及CDK2激酶抑制活性半數(shù)抑制濃度值值達(dá)到了nM級(jí)。由于Roscovitine對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有較高的抑制作用以及副作用較小，目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)。2）Flavopiridol是一種源于植物的黃酮類化合物，從樹皮中提取出純化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，人工合成了一系列衍生物。臨床前研究顯示，F(xiàn)lavopiridol具有廣譜的CDKs抑制活性，其中對(duì)CDK1、CDK2及CDK4激酶活性的抑制作用尤其明顯［32-33］。盡管Flavopiridols對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，但由于其對(duì)正常細(xì)胞毒性較為嚴(yán)重，因此開發(fā)與之藥理作用相近但正常細(xì)胞毒性較少的CDKs抑制劑成為必然，在對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)后獲得了Paullones衍生物。3）Paullones類化合物對(duì)CDK1和CDK2及CDK5有特異性的抑制作用，其中，Alsterpaullone和Kenpaullone對(duì)CDKs激酶的半數(shù)抑制濃度均已達(dá)到nM級(jí)，且毒性作用較低。因此，基于細(xì)胞周期調(diào)控分子CDKs在腫瘤發(fā)生中的重要作用，CDKs抑制劑的開發(fā)成為腫瘤治療的新亮點(diǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)

本文以細(xì)胞周期為核心，系統(tǒng)分析了細(xì)胞周期對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)影響，及相應(yīng)的臨床診斷和藥物治療的意義。為深入了解惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的腫瘤診斷、治療靶點(diǎn)和制定治療方案提供新的思路和理論依據(jù)。

1 Zhan Q.Gadd45a,a p53-and BRCA1-regulated stress protein,in cellular response to DNA damage[J].Mutat Res,2005,569(1-2):133-143.

2 Zhan Q,Chen IT,Antinore MJ,et al.Tumor suppressor p53 can participate in transcriptional induction of the GADD45 promoter in the absence of direct DNA binding[J].Mol Cell Biol,1998,18(5):2768-2778.

3 Jin S,Tong T,Fan W,et al.GADD45-induced cell cycle G2-M arrest associates with altered subcellular distribution of cyclin B1 and is independent of p38 kinase activity[J].Oncogene,2002,21(57):8696-8704.

4 Gao H,Jin S,Song Y,et al.B23 regulates Gadd45a nuclear translocation and contributes to Gadd45a-induced cell cycle G2-M arrest[J].J Biol Chem,2005,280(12):10988-10996.

5 Shao S,Wang Y,Jin S,et al.Gadd45a interacts with aurora-a and inhibits its kinase activity[J].J Biol Chem,2006,281(39):28943-28950.

6 Jin S,Zhao H,Fan F,et al.BRCA1 activation of GADD45 promoter[J].Oncogene,2000,19(35):4050-4057.

7 Fan W,Jin S,Tong T,et al.BRCA1 regulates GADD45 through its interactions with the OCT-1 and CAAT motifs[J].J Biol Chem,2002,277(10):8061-8067.

8 Wang Y,Zhan Q.Cell cycle dependent expression of centrosomal ninein-like protein in human cells is regulated by the anaphase-promoting complex[J].JBiolChem,2007,282(24):17712-17719.

9 Li J,Zhan Q.The role of centrosomal Nlp in the control of mitotic progression and tumourigenesis[J].Br J Cancer,2011,104(10):1523-1528.

10 Shao S,Liu R,Wang Y,et al.Centrosomal Nlp is an oncogenic protein that is gene-amplified in human tumors and causes spontaneous tumorigenesis in transgenic mice[J].J Clin Invest,2010,120(2):498-507.

11 Zhao W,Song Y,Xu B,et al.Overexpression of centrosomal protein Nlp confers breast carcinoma resistance to paclitaxel[J].Cancer Biol Ther,2012,13(3):156-163.

12 Song Y,Zhao C,Dong L,et al.Overexpression of cyclin B1 in human esophageal squamous cell carcinoma cells induces tumor cell invasive growth and metastasis[J].Carcinogenesis,2008,29(2):307-315.

13 Ou Y,Ma L,Ma L,et al.Overexpression of cyclin B1 antagonizes chemotherapeutic-induced apoptosis through PTEN/Akt pathway in human esophageal squamous cell carcinoma cells[J].Cancer Biol Ther,2013,14(1):45-55.

14 Ruan Y,Song AP,Wang H,et al.Genetic polymorphisms in AURKA and BRCA1 are associated with breast cancer susceptibility in a Chinese Han population[J].J Pathol,2011,225(4):535-543.

15 Provencio M,Camps C,Cobo M,et al.Prospective assessment of XRCC3,XPD and Aurora kinase A single-nucleotide polymorphisms in advanced lung cancer[J].Cancer Chemother Pharmacol,2012,70(6):883-890.

16 Hook KE,Garza SJ,Lira ME,et al.An integrated genomic approach to identify predictive biomarkers of response to the aurora kinase inhibitor PF-03814735[J].Mol Cancer Ther,2012,11(3):710-719.

17 Zou L,Sun Y,Wang M,et al.Aurora-A interacts with AP-2α and down regulates its transcription activity[J].Plos One,2011,6(8):e23110.

18 Tong T,Zhong Y,Kong J,et al.Overexpression of Aurora-A contributes to malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(21):7304-7310.

19 Wang XX,Liu R,Jin SQ,et al.Overexpression of Aurora-A kinase promotes tumor cell proliferation and inhibits apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cell line[J].Cell Res,2006,16(4):356-366.

20 Musgrove EA,Caldon CE,Barraclough J,et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(8):558-572.

21 Saini SS,Klein MA.Targeting cyclin D1 in non-small cell lung cancer and mesothelioma cells by antisense oligonucleotides[J].Anticancer Res,2011,31(11):3683-3690.

22 Scaltriti M,Eichhorn PJ,Cortés J,et al.Cyclin E amplification/overexpression is a mechanism of trastuzumab resistance in HER2+breast cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(9):3761-3766.

23 Huang LN,Wang DS,Chen YQ,et al.Meta-analysis for cyclin E in lung cancer survival[J].Clin Chim Acta,2012,413(7-8):663-668.

24 Davidson B.The diagnostic and molecular characteristics of malignant mesothelioma and ovarian/peritoneal serous carcinoma[J].Cytopathology,2011,22(1):5-21.

25 Maglic D,Zhu S,Fry EA,et al.Prognostic value of the hDMP1-ARF-Hdm2-p53 pathway in breast cancer[J].Oncogene,2013,32(35):4120-4129.

26 Eischen CM,Boyd K.Decreased Mdm2 expression inhibits tumor development and extends survival independent of Arf and dependent on p53[J].PLoS One,2012,7(9):e46148.

27 Radu M,Semenova G,Kosoff R,et al.PAK signalling during the development and progression of cancer[J].Nat Rev Cancer,2013,14(1):13-25.

28 Warfel NA,El-Deiry WS.p21WAF1 and tumourigenesis:20 years after[J].Curr Opin Oncol,2013,25(1):52-58.

29 Wei F,Xu J,Tang L,et al.p27(Kip1)V109G polymorphism and cancer risk:a systematic review and meta-analysis[J].Cancer Biother Radiopharm,2012,27(10):665-671.

30 Borriello A,Bencivenga D,Criscuolo M,et al.Targeting p27Kip1 protein:its relevance in the therapy of human cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(6):677-693.

31 Wander SA,Zhao D,Slingerland JM.p27:a barometer of signaling deregulation and potential predictor of response to targeted therapies[J].Clin Cancer Res,2011,17(1):12-18.

32 Hayashi T,Adachi K,Ohba S,et al.The Cdk inhibitor flavopiridol enhances temozolomide-induced cytotoxicity in human glioma cells[J].J Neurooncol,2013,115(2):169-178.

33 Blachly JS,Byrd JC.Emerging drug profile:cyclin-dependent kinase inhibitors[J].Leuk Lymphoma,2013,54(10):2133-2143.