人骨髓間充質干細胞的分離和培養及向軟骨細胞分化的實驗研究

林增平 鐘繼平 聶達榮

1 材料與方法

1.1 材料 ①DMEM/F12細胞培養基、優質原裝進口100%胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA細胞消化液(美國GIBCO公司)。②正轉化生長因子β-1(TGF-β1)、生長因子［IGF-I(美國Peprotech公司)］。③1.075 g/ml人淋巴細胞分離液(津脈基因測繪技術有限公司)。④Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(Boster)。⑤FICT標記鼠抗人CD44、CD45單克隆抗體(晶美生物)。

1.2 方法

1.2.1 取材 人骨髓10 ml, DMEM/F12稀釋1倍, 與人淋巴細胞分離液1：2混合, 密度梯度離心(2000 r/min)10 min, 吸取中間層的單核細胞(呈云霧狀), 再離心(2000 r/min)5 min。使用完全培養液將沉淀物制成密度為1×105/ml的懸浮液。吸取6 ml該細胞懸浮液, 置入培養箱中培養, 每3天換液1次,鏡下觀細胞達90%～95%左右融合時, 用細胞消化液消化, 1：3傳代, 傳代培養時, 細胞的密度為8×103/cm2較為適宜(注：完全培養液：DMEM/F12中含10%的胎牛血清(FBS)+維生素C 0.05 g/L+青霉素10 U/L+鏈霉素0.1 g/L。細胞消化液：0.25%胰酶+0.02%EDTA)。

1.2.2 BMSCs的鑒定［1］取3 ml第3代細胞密度為5×105/ml與5 μlFICT標記的鼠抗人一抗混合, 待兩者充分結合后,緩沖液洗2次后制成懸浮液, 使用流式細胞儀檢測CD44、CD45抗原表達情況。

1.2.3 取第3代人骨髓間充質干細胞懸浮液置于培養板中,該培養板底部放置一蓋玻片, 置入的細胞密度為8×103/cm2,放入培養箱3 d 后改為軟骨細胞誘導液繼續培養14 d, 再將上述蓋玻片行甲苯胺藍染色、HE染色及Ⅱ型膠原免疫組化,設完全培養液組為陰性對照, 緩沖液代替Ⅱ型膠原為空白對照。(注：軟骨細胞誘導液：DMEM/F12中含5%的FBS, 6.25 ng/ml的TGF-β1, 50 ng/ml的IGF-I, 地塞米松40 ng/ml, 維生素C 0.05 g/L, 青霉素10 U/L, 鏈霉素0.1 g/L)。

2 結果

2.1 原代培養 24 h后細胞開始貼壁, 剛貼壁的細胞呈圓形, 隨后逐漸伸出偽足, 以短小梭形為主, 細胞呈集落樣分布, 集落區數目不一, 一個集落區內細胞數目也不一。3 d后首次換液, 大量懸浮細胞去處(主要是紅細胞), 鏡下可見短小梭形細胞較前增多, 但排列無方向性。隨換液時間延長,細胞形態逐漸趨向一致, 以中等梭形為主。第11天細胞已達80～90%左右融合, 此時細胞增殖速度較前減慢。傳代后細胞增殖明顯加快。形態較均一, 呈中等梭形, 排列有方向性, 旋渦樣、同心圓樣分布。第6天細胞已達95%以上融合。第8代后細胞生長減慢, 形態不規則, 排列失去方向性, 胞內黑色顆粒增多, 折光性能差, 開始出現老化。

2.2 細胞表型鑒定 單參數流式細胞儀檢測CD44陽性率為88.6%, 其陰性對照組為0.84%。CD45陽性率為0.73%, 其陰性對照組為0.82%。

2.3 BMSCs的定向分化 HE染色可見細胞呈梭形, 核為橢圓形, 核仁2～4個不等。甲苯胺蘭染色誘導組細胞外基質出現紫紅色異染, 對照組及空白組未被染色。Ⅱ型膠原免疫組化誘導組可見胞漿染成棕黃色, 局部為深黃色, 陰性對照組及空白組未見有棕黃色。

3 討論

軟骨缺損或損傷是常見的疑難病癥之一。軟骨細胞幾乎沒有遷徙能力, 增生能力差, 再生能力低, 因此軟骨缺損或損傷后難以自體修復。而且自體或異體移植成形的軟骨因其生物性能、耐磨性、韌性均欠佳, 易蛻變。由于軟骨細胞取材難、來源有限, 同時體外培養時易去分化, 因此不適合作為種子細胞。然而骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有來源充足, 取材容易, 能夠自我更新增殖, 而且還具有向骨、軟骨、脂肪等多向分化潛能, 已成為組織工程中的理想種子細胞。本實驗抽取成人骨髓, 消除了種屬間不相容的弊端, 更適合于臨床應用。由于BMSCs表面缺乏特異性特征, 目前其鑒定重要通過陰性選擇及陽性選擇相結合。本實驗選擇生長良好的第3代細胞, 使用流式細胞儀, 結果顯示 CD44陽性率為88.6%,CD45陽性率為0.73%, 研究表明CD44是BMSCs重要抗原標記之一, 而CD45是造血干細胞抗原標記, BMSCs不表達CD45, 因此結果顯示所取的第3代細胞為純度較高的BMSCs,其中還含有少量的造血干細胞以及極少量的巨噬細胞和單核細胞。同時也表明采用貼壁培養與密度梯度離心法相結合,能夠分離到純度較高的BMSCs。而且所獲得的BMSCs具有自我更新增殖的能力, 但7代后細胞開始出現增殖速度變慢,第8代時更明顯, 且部分細胞失去原有的梭形狀, 變的寬大扁平, 折光性下降, 出現老化現象, 因此BMSCs并不具有無限自我更新增殖的能力。

研究表明軟骨細胞代謝物質有助于BMSCs向軟骨細胞分化, 而軟骨細胞能分泌較多的TGF-β1、IGF-I等, 因此TGF-β1、IGF-I均有助于BMSCs向軟骨細胞分化［2］。在一定的條件下, TGF-β1的溶度范圍與BMSCs的轉化率呈劑量-效應關系, 有研究表明5～10 μg/L TGF-β1能提高BMSCs向軟骨細胞轉化率, 且能刺激BMSCs分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。有研究發現使用10 μg/L TGF-β1不僅有助于BMSCs向軟骨細胞分化, 而且還能維持軟骨細胞表型。TGF-β1與IGF-I在促進BMSCs向軟骨細胞分化過程中具有協同效應,IGF-I可促進軟骨細胞的有絲分裂和細胞外基質的Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的合成, 但對于IGF-I與BMSCs向軟骨細胞轉化率的劑量-效應關系研究尚少, 本實驗在含有5%的胎牛血清中, 將6.25 ng/ml TGF-β1與50 ng/ml IGF-I聯合應用, 經軟骨細胞誘導后, 通過測定蛋白聚糖和Ⅱ型膠原分泌情況而證實BMSCs是否向軟骨細胞分化, 本實驗結果證實, BMSCs經誘導后分泌了具有軟骨細胞特性的基質-蛋白聚糖和Ⅱ型膠原, 本實驗條件能夠使BMSCs向軟骨細胞分化。但對于TGF-β1、IGF-I、BMSCs向軟骨細胞轉化率三者之間的劑量-效應關系, 還需進一步研究, 同時本實驗未見明顯的軟骨陷窩及同源細胞群, 因此尋找更適合于BMSCs向軟骨細胞分化的條件也還需進一步研究。

［1］Sakai D, Mochida J, Iwashina T, et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc.Biomaterials, 2006, 27(3):335-345.

［2］裴國獻, 金丹.骨組織工程研究進展.中華創傷骨科雜志,2004, 6(1):38-42.