白細胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血單一核細胞及血清中的表達

孫怡 王振華

白細胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血單一核細胞及血清中的表達

孫怡 王振華

目的探討白細胞介素(IL)-22在玫瑰糠疹發(fā)病機制中的作用。方法熒光實時定量反轉錄(RT)-PCR檢測玫瑰糠疹患者急性期、恢復期及健康對照組PBMC中IL-22mRNA的表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中IL-22的水平。結果玫瑰糠疹患者急性期、恢復期及健康對照組PBMC中IL-22 mRNA的相對表達量分別為4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60,急性期明顯高于恢復期(t=3.61,P＜0.05),恢復期高于健康對照組(t=3.84,P＜0.05)。玫瑰糠疹患者急性期、恢復期及健康對照組血清中IL-22水平分別為(36.87±10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L,急性期明顯高于恢復期(t=5.01,P＜0.05),恢復期高于健康對照組(t=4.49,P＜0.05)。血清IL-22水平與玫瑰糠疹病程呈正相關(r=0.883,P＜0.05)。結論IL-22在玫瑰糠疹患者外周血及血清中表達明顯升高,可能在玫瑰糠疹的發(fā)病中起一定作用。

糠疹,玫瑰;白細胞介素22;發(fā)病機制

玫瑰糠疹病因及發(fā)病機制不明,目前學者多認為該病與病毒感染和細胞免疫平衡失調有關。近期的研究發(fā)現(xiàn),玫瑰糠疹患者表皮浸潤的細胞主要為輔助/誘導T淋巴細胞,表皮、真皮乳頭內朗格漢斯細胞明顯增多,表明細胞免疫反應參與了本病的發(fā)生。白細胞介素(IL)-22屬于IL-10細胞因子家族,主要由激活的Thl淋巴細胞、Th17細胞等產生,主要作用靶細胞為上皮細胞。我們檢測IL-22在玫瑰糠疹急性期及恢復期患者外周血單一核細胞及血清中的表達,探討IL-22在玫瑰糠疹發(fā)病中的作用。

一、對象與方法

(一)臨床資料:收集2011年9月至2012年10月在濰坊市人民醫(yī)院皮膚科門診就診、經臨床確診并符合以下條件的患者:①均有典型的臨床表現(xiàn),發(fā)病3～10 d;②受試前臨床檢查未發(fā)現(xiàn)急性感染征象,無其他免疫相關性疾病,發(fā)病后未接受系統(tǒng)用藥及外用藥物治療。不合并有肝、腎及其他嚴重系統(tǒng)性疾病,非懷孕或哺乳期婦女,無非婚性接觸史。共收集48例急性期玫瑰糠疹患者,其中男28例,女20例,年齡15～45(30.1±12.5)歲。恢復期為以上所有患者經窄譜中波紫外線(NB-UVB)治療后皮疹消退,病程為14～52(32.85± 19.17)d。健康對照組為性別、年齡與病例組相匹配的同期健康體檢者20例。

(二)治療方法:給予患者NB-UVB治療,初始照射劑量根據(jù)患者皮膚類型而定,一般為0.4～0.6 J/cm2,每次照射劑量較前次增加0.1 J/cm2,每周治療3次。記錄治療次數(shù),當皮損基本消退、療效指數(shù)(即治療前癥狀體征評分-治療后癥狀體征評分/治療前癥狀體征評分)＞90%時停止照射,治療結束1周后采集靜脈血。治療次數(shù)為4～14(8.2±4.8)次。

(三)主要試劑和儀器:Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液產自美國Invitrogen公司;RNAiso Plus、一步法反轉錄RT試劑盒、實時PCR試劑盒均產自日本TaKaRa公司;IL-22 ELISA檢測試劑盒產自美國RD公司;熒光定量PCR儀(Icycler IQ Multicolor實時PCR檢測系統(tǒng))為美國Bio-Rad公司產品。

(四)實驗方法:

1.血清和PBMC的分離:無菌條件下分別采集玫瑰糠疹患者急性期、恢復期和健康對照組外周乙二胺四乙酸抗凝血5 ml,室溫1 500 r/min(離心半徑15 cm)10 min,提取血清,分裝入凍存管中。用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得PBMC,將PBMC裝于1.5 ml微量離心管。標本均置于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.PBMC中IL-22基因的檢測:①提取RNA:按RNA提取試劑盒說明書提取PBMC總RNA,紫外分光光度計測定RNA含量;②RNA反轉錄:cDNA合成按照逆轉錄試劑盒說明書操作;③實時定量PCR:使用定量PCR反應儀,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,管家基因β肌動蛋白引物序列:上游為5′-CAAGCCTCCCAGTCCAAGAT-3′,下游為5′-ATTGCTGATGTCATAAGGGC-3′;IL-22 mRNA引物序列:上游為5′-CCAGGCTCAGCAACAGGCTAA-3′,下游為5′-TTTCAGCTCTGGTCAAATG-3′。采用25 μl反應體系,其中SYBR Green實時PCR Master Mix 12.5 μl,下游引物(10 μmol/L)各1 μl,模板溶液2.5 μl,反應條件為95℃60 s變性,然后95℃15 s,60℃15 s,72℃45 s,40個循環(huán)。收集熒光信號,得到每個標本不同指標的Ct值,以β肌動蛋白mRNA的量為內參照,根據(jù)公式2-△△Ct計算所測指標的相對表達量。

3.血清IL-22水平的測定:應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-22水平,具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度,并根據(jù)標準品的吸光度所對應的濃度繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

(五)統(tǒng)計學處理:采用SPSSl6.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示,兩組間比較采用t檢驗。采用Pearson進行相關性分析;檢驗水準α=0.05。

二、結果

1.PBMC中IL-22 mRNA的表達:急性期、恢復期玫瑰糠疹患者及健康對照組PBMC中IL-22 mRNA的相對表達量分別為4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60;急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA的表達明顯高于恢復期(t=3.61,P＜0.05),恢復期高于健康對照組(t=3.84,P＜0.05)。

2.血清中IL-22的表達水平:急性期、恢復期玫瑰糠疹患者和健康對照組血清中IL-22水平分別為(36.87± 10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L。急性期玫瑰糠疹患者血清中IL-22水平明顯高于恢復期(t=5.01,P＜0.05),恢復期IL-22水平高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=4.49,P＜0.05)。

3.相關性分析:急性期玫瑰糠疹患者血清IL-22的水平(36.87±10.63)ng/L與玫瑰糠疹病程(32.85±19.17)d呈正相關(r=0.883,P＜0.05),與治療次數(shù)呈正相關(r=0.751,P＜0.05)。

三、討論

玫瑰糠疹發(fā)病原因仍未明確,但群集發(fā)病、很少復發(fā)、臨床表現(xiàn)為發(fā)疹性皮疹及自限性病程等特點支持其發(fā)病與感染有關。已經有很多研究表明玫瑰糠疹發(fā)病與多種病毒感染[包括人類皰疹病毒(HHV)-6、HHV-7及甲型H1N1流感病毒等]有關[1-3]。還有研究[4]顯示,T細胞在玫瑰糠疹的發(fā)生發(fā)展中起主要介導作用,與抗原提呈細胞密切相互作用,釋放各種細胞因子,引起特異性免疫反應。

玫瑰糠疹和銀屑病有很多相似之處,都是T細胞介導的炎癥性皮膚病,且玫瑰糠疹也出現(xiàn)表皮角化不全、輕度棘層肥厚及真皮炎癥。因此,與銀屑病發(fā)病密切相關的IL-22同樣也可能參與玫瑰糠疹的發(fā)病。Gangemi等[5]檢測病情處于早期的16例玫瑰糠疹血清中IL-22水平,結果發(fā)現(xiàn),患者血清中IL-22水平顯著高于對照,但該研究病例數(shù)較少且僅對玫瑰糠疹早期患者的血清進行檢測。本文研究結果顯示,急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA表達水平明顯高于恢復期及健康對照組,恢復期亦明顯高于健康對照組。玫瑰糠疹急性期血清IL-22明顯高于恢復期及健康對照者。提示玫瑰糠疹患者中IL-22高表達,而作為分泌IL-22主要來源的Th17細胞可能參與玫瑰糠疹的發(fā)病。

[1]Wolk K，Witte E，Wallace E，et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation，and mobility in keratinocytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol，2006，36(5):1309-1323.

[2]Boniface K，Bernard FX，Garcia M，et al.IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes[J].J Immunol，2005，174(6): 3695-3702.

[3]Zheng Y，Danilenko DM，Valdez P，et al.Interleukin-22，a T(H) 17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis[J].Nature，2007，445(7128):648-651.

[4]孫曉杰，劉文力，李鐵男，等.玫瑰糠疹與人類皰疹病毒6型的關系[J].中華皮膚科雜志，2004，37(10):607.

[5]Gangemi S，Minciullo PL，Guarneri F，et al.Increased serum levels of interleukin-22 in patients affected by pityriasis rosea [J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2009，23(7):858-859.

2013-10-31)

(本文編輯:尚淑賢)

Expressions of interleukin-22 in sera and peripheral blood mononuclear cells of patients with pityriasis rosea

Sun Yi，Wang Zhenhua.Department of Dermatology，Weifang People′s Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email:wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo investigate the role of interleukin-22(IL-22)in the pathogenesis of pityriasis rosea(PR).MethodsPeripheral venous blood samples were obtained from 48 patients with PR in acute stage and recovery stage and from 20 healthy human controls.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of IL-22 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the level of IL-22 in sera.ResultsThe relative expression level of IL-22 mRNA in the patients with PR in recovery stage was significantly higher than that in the healthy controls(2.89± 0.91 vs.1.91±0.60，t=3.84，P＜0.05)，but lower than that in the patients in acute stage(2.89±0.91 vs.4.15± 1.36，t=3.61，P＜0.05).Similarly，the level of serum IL-22 was significantly increased in the patients with PR in recovery stage compared with the healthy controls((21.44±7.33)vs.(13.22±4.26)ng/L，t=4.49，P＜0.05)，and increased in the patients with PR in acute stage compared with those in recovery stage((36.87±10.63)vs. (21.44±7.33)ng/L，t=5.01，P＜0.05).The level of serum IL-22 was positively correlated with the stage of PR (r=0.883，P＜0.05).ConclusionsIL-22 is overexpressed in PBMCs and sera of patients with PR，implying that IL-22 is involved in the pathogenesis of PR.

Pityriasis rosea;Interleukin-22;Pathogenesis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.022

261041山東,濰坊市人民醫(yī)院皮膚科

王振華,Email:wfzcwzh@126.com