糙皮側耳遺傳學研究進展*

徐榮榮，圖力古爾

(1.吉林農業大學菌物研究所，吉林 長春 130118； 2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，農業部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081)

糙皮側耳遺傳學研究進展*

徐榮榮1，2，圖力古爾1**

(1.吉林農業大學菌物研究所，吉林 長春 130118； 2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，農業部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081)

糙皮側耳是我國栽培的主要食用菌之一，從基因組學、數量基因座位、主要農藝性狀等方面綜述了糙皮側耳的遺傳學研究進展。

基因組；數量基因座位；木質素氧化酶；疏水蛋白

糙皮側耳是側耳屬的模式種，是世界上廣泛栽培的食用菌之一。糙皮側耳俗稱平菇，據中國食用菌協會統計數字，我國平菇大面積的栽培歷史始于上世紀70年代[1]，在2012年以前平菇基本上是中國栽培量最大的食用菌，平菇產量占全國食用菌總產量的14，平菇肉質肥嫩，營養豐富，富含蛋白質、膳食纖維、礦物質等多種營養成分，研究表明其胞內組分和次級代謝物如多糖、糖蛋白、血凝素、纖維、萜類化合物、類固醇、核酸等能夠降低血脂和血糖水平[2]，具有抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗衰老、抗組織胺、抗氧化活性[3]，能夠降解膽固醇，調節免疫等多種功效[4]，是具開發前景的藥用真菌，在食品和醫藥等領域具有廣闊的發展前景。因此，明確糙皮側耳的遺傳學背景，具有非常重要的意義。本文從基因組水平、數量性狀定位、酶學水平3個方面論述糙皮側耳的遺傳學研究進展。

1 基因組學研究進展

1.1 染色體基因組

1.2 線粒體基因組

線粒體是真核細胞的1種重要細胞器，它在細胞代謝和生理過程中發揮著重要作用。線粒體基因組從它形成開始就伴隨著核基因組DNA共同進化。NCBI網站已公布73種真菌線粒體基因組全序列。糙皮側耳(Pleurotusostreatus)線粒體基因組的全序列在GenBank 中登錄號為NC_009905。Yong等[6]對糙皮側耳的線粒體基因組進行了測序和分析，結果表明糙皮側耳的線粒體DNA為圓形，全長 73 242 bp，GC含量為26.4%，通過BLAST核苷酸序列比對得出整個線粒體基因組中包含了44個基因，他們編碼18個蛋白和26個RNA，包括細胞色素氧化酶的3個亞基基因cox1、cox2、cox3，1個細胞色素b基因(cytb)，還原性輔酶Ⅰ的6個亞基基因nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6，3個ATP合成酶亞基基因atp6、atp8、atp9。1個核糖體小亞基蛋白基因rps3，1個RNA聚合酶基因rpo，2個DNA聚合酶基因dpo1、dpo2，2個rRNA基因亞基rns和rnl，24個tRNA基因。此外P.ostreatus線粒體還有15個未知功能的開放閱讀框。P.ostreatus線粒體基因組是唯一一個已報道的食用真菌線粒體基因組，這一研究成果將為以后食用菌線粒體的研究起到巨大的推動作用。

1.3 端粒基因組

端粒存在于染色體的末端，保證了染色體結構功能的穩定性，由5 bp～8 bp的隨機重復序列組成。端粒縮短會導致染色體結構不穩定,引起復制性衰老和凋亡[7]，端粒及其近端結構中含有的物種特異性基因和應激性基因使生物體快速適應不同的生存環境[8]。

Pérez等[9]將糙皮側耳P.ostreatusN001和2個原生質體菌株PC9、PC15及80個單核子代作為研究對象，定位了11條染色體中的19個端粒。確定端粒大小為 600 bp～1 600 bp，每個端粒中有7個～55個42 bp～330 bp的TTAGGG重復單元。6號和7號染色體端粒的限制性片段和泛素基因 (MV100-1、MV100-2和MV094-3)、漆酶基因(poxC、DyP)相連鎖。端粒及其近端結構域存在RecQ解旋酶基因、異核不相容基因和脫氫酶基因。P.ostreatus的6號染色體近端結構的250 kb處存在1個漆酶基因簇，作為特異性基因使糙皮側耳快速適應新的木質素培養基。

2 糙皮側耳QTL研究

食用菌中大多數重要農藝性狀，如產量、品質、菌絲生長速度等均表現數量性狀的遺傳特點，即受環境因子和多個數量基因座位(Quantitative Trait Loci, QTL)的共同作用。遺傳研究中經常將控制數量性狀的多基因作為1個整體，通過數理統計學來剖析和描述QTL的遺傳特征。Larraya等[10]利用80個孢子單核體作為作圖群體，以178個DNA隨機擴增多態性片段、23個RFLP標記、4個疏水蛋白、2個漆酶、2個錳過氧化物酶基因、2種交配型基因座、1個同工酶基因位點為基礎，構建了覆蓋整個糙皮側耳基因組的遺傳連鎖圖，共涉及11個染色體，總長 10 007 cM，平均35.1 kbp·cM-1，其物理圖譜和遺傳圖譜中染色體大小的相似性高達76%。隨后在該連鎖圖的基礎上，引入5個外源的測交單核體，與作圖群體配對獲得5個測交雙核體群體，通過測定單核菌絲在SEM(Solid Eger Medium)培養基和稻草培養基上的生長速度，共檢測到分布于第1號、第2號、第4號、第6號、第7號、第8號、第11號等7個染色體中的12個QTL，解釋了雙核菌絲生長速度6.26%～25.90%的變異。共有5個QTL與單核菌絲生長速度相關；其中與SEM培養基上單核菌絲生長速度相關的2個QTL，分別位于第4號和第8號染色體，共同解釋了38.46%的生長速度變異，另外與稻草培養基上的單核菌絲生長速度相關的3個QTL分別位于第4號、第8號、第11號染色體，可以共同解釋41.19%的單核體生長速度變異。分別有2個QTL位于第7號和第11號2號染色體中的相同位點，推測這2個QTL位點是相對穩定存在的。此外4個位于第8號，染色體上的獨立的QTL與酯酶同工酶家族est1基因存在連鎖關系，而攜帶不同est1等位基因的單核體菌絲生長速度顯著不同，表明該基因可能是參與調控菌絲生長速度的候選基因[11]。第11個染色體上的2個與雙核菌絲生長速度相關的QTL，與只在營養生長期表達的疏水蛋白編碼基因Vmh2緊密連鎖，因此Vmh2也可以作為這個QTL的候選基因。

該研究小組[12]利用1個測交群體在基因連鎖圖內對糙皮側耳10個產量相關性狀，以及4個品質相關性狀進行QTL定位，總共鑒定到控制產量性狀的18個QTL，解釋了5.70%～48.36%產量性狀變異。其中1個QTL定位于具有高度多態性的第7號染色體涉及到所有產量相關性狀，而且與雙核菌絲生長速度相關的2個QTL緊密連鎖，然而質量性狀10個QTL分散在整個基因組中，對質量性狀的變異貢獻不大，僅為3.73%～11.14%。隨后Park等[13]將82個在菌褶中表達的功能基因添加到遺傳圖譜中，注解了31.4%的菌褶中表達的基因和71.5%序列及功能未知的蛋白基因，為糙皮側耳從營養生長和生殖生長的轉變過程中基因調節提供研究基礎。

這幾天盤存下來，丁主任的臉色越來越難看，最后看著這個少了這么多東西的清單，臉上幾乎揪得出水來，他臉色凝重地對著大家，其實甲洛洛感覺是只針對他一個人說的：大家回去想想是怎么回事吧，如果明天早上上班前還想不出來，我們就只有報案了。

Santoyo等[14]在之前作圖群體的基礎上提出了酶活性QTL(Enzyme Activity QTL)概念。將糙皮側耳菌株N001減數分裂得到的80個單核體作為作圖群體，以錳過氧化物酶(Manganese Peroxidases,MnP)、多功能過氧化物酶(Versatile Peroxidases,VP)和酚氧化酶(Phenol oxidases,Pox)的酶活代替基因結構作為數量性狀，采用極大似然法以 0.5 cM 為最小單位進行復合區間作圖，繪制了木質素氧化酶基因圖譜，對比顯示這些數量性狀與相應的編碼基因，其在染色體中的位置并不相同，通用過氧化物酶(VP)的編碼基因mnp1和錳過氧化物酶(MnP)的編碼基因mnp3位于第4號、第5號和第6號染色體上，而MnP與VP活性QTL定位在第6號和第11號染色體上，酚氧化酶(Pox)活性QTL定位在第4號和第6號染色體上，錳過氧化物酶(MnP)活性QTL定位在第5號染色體上，其他2個微效QTL單獨定位在2號染色體上。研究結果表明，第6號染色體上的QTL與錳過氧化物酶基因mnp2的表達有關，第4號染色體上的1個主效QTL，第8號和第10號染色體上的微效QTL與Pox的活性有關，但這些QTL與已知的pox基因家族在基因組中的位置并無連鎖關系。隨著P.ostreatus全基因組測序工作的展開和完成，應該借助新型分子生物學技術手段，開發和定位出更多的QTL，為食用菌基因資源的開發利用奠定堅實的基礎。

3 主要農藝性狀遺傳學研究

3.1 木質素氧化酶遺傳研究

糙皮側耳生長所需的營養成分來源于培養基中木質纖維素的降解，而木質素是難分離的大分子，木質素分解能力強弱決定著菌株生長狀態的好壞，進而影響產量的高低。木質素降解是氧化過程，錳過氧化物酶(MnP)、多功能過氧化物酶(VP)、細胞外酚氧化酶-漆酶(Laccase)是3種主要的木質素氧化酶酶類[15]。

錳過氧化物酶(Mnp)是1種依賴Mn2+的含血紅素的過氧化物酶。該酶廣泛存在于白腐菌中[16]。Mnp最早在黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)中發現[17]。錳過氧化物酶(MnPs)是最常見的胞外分泌的木質素分解酶，可以將Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+再被包括乙醇酸鹽、草酸鹽等在內的有機酸螯合劑固定，從而使其由活性位點中被釋放出來，直接將底物催化氧化成對應的自由基。錳過氧化物酶基因家族共有9個成員，分別為3個通用錳過氧化物酶基因，Mnp2、Mnp4、Mnp5和6個短錳過氧化物酶基因Mnp1、Mnp3、Mnp6、Mnp7、Mnp8和Mnp9。其中Mnp2和Mnp1核苷酸序列相似性為81%，Mnp2和Mnp3核苷酸序列相似性為66%，Mnp1和Mnp3核苷酸序列相似性為69%。Mnp2、Mnp1和Mnp3編碼基因在編碼區的G+C含量分別為57.9%、68%和63.7%[18]。

多功能過氧化物酶(VP)在側耳屬和煙管菌屬被發現。它們與Mn2+離子、對二苯酚、染料有密切的關系，可以使藜蘆基醇、藜蘆醚和木質素二聚體氧化[19]。多功能過氧化物酶(VP)在pH為5的最適條件下將Mn2+氧化成Mn3+，在pH為3的最適條件下將木質素氧化分解為藜蘆醛，并將藜蘆基醇和對二甲氧基苯分別氧化為藜蘆醛和對苯醌。多功能過氧化物酶(VP)具有2個同工酶VP-LP與VP-PS1。Ruiz-Duenas等[20]利用DNA探針，采用相應引物獲得多功能過氧化物酶(VP)的同工酶(VP-LP)的基因。該基因有2個等位基因PL1、PL2，二者核苷酸序列具有99%的相似性，僅在N端存在1個堿基替換。VP-PS1基因與VP-PL基因都含有15個內含子，有74%的序列相似性。VP-PL和VP-PS1轉錄翻譯蛋白的序列相似性為74%。與GenBank中糙皮側耳錳過氧化物酶(MnP)基因對比顯示，VP-PS1與Mnp2具有98%的序列相似性，VP-PS1與Mnp3具有77%的序列相似性。

漆酶(Laccase)也稱作多酚氧化酶，屬于藍銅氧化酶類，能將氧氣作為電子受體去除酚羥基中的氫自由基。在糙皮側耳的形態發生、營養、防御、木質素降解過程中都起著重大作用。研究表明糙皮側耳中具有11個漆酶基因，分別位于6號染色體的端粒的近端區域及第4號、第6號、第7號、第8號、第11號染色體上，其中lacc6有lacc2表達水平最高是漆酶活動的主要來源[21]。Giardina等[22]從糙皮側耳中分離出漆酶基因pox1及其亞型pox2。pox1基因大小為 2 592 bp，含有19個內含子，在5’上游序列的174 bp和84 bp處分別含有1個CAAT和TATA的共有序列。經克隆分析對比pox2與pox1的cDNA具有84%的序列相似性，pox1和pox2具有了5個氨基酸的替換差異，二者N端序列和胰蛋白酶肽的cDNA序列相同。pox1含有1個特異的HindIII位點，pox2含有1個BamHI位點，PCR驗證表明這2個基因并非等位基因，而是獨立進化而來的2個同工酶基因。漆酶基因的表達受營養水平、培養條件和環境中誘導物的影響，Palmieri等[23]發現了糙皮側耳中漆酶基因poxa1b，銅離子的誘導能明顯提高poxa1b的轉錄水平。Pezzella等[21]以銅離子和阿魏酸作為誘導物分析漆酶基因轉錄情況，結果顯示銅離子誘導了lacc9、lacc10和lacc2基因的表達，阿魏酸誘導了lacc9、lacc10和lacc2基因的表達；在分化后期2個誘導物都存在的情況下，lacc6出現超表達現象；lacc9、lacc10在子實體階段的表達水平下降，lacc12在子實體形成階段的表達量增加，lacc1、lacc6、lacc7和lacc8的表達量有較小水平的增加。

3.2 疏水蛋白

疏水蛋白對菌絲的生長有很大的促進作用。在糙皮側耳生長發育過程中能降低培養基的表面張力，促進菌絲扭結，對抗干燥，促進氣體交換，輔助基內菌絲脫離水相環境轉變為氣生菌絲[24]。糙皮側耳中的疏水蛋白由100個氨基酸組成，含有8個高度保守半胱氨酸殘基和1段長約20個氨基酸的信號肽序列[25]，糙皮側耳疏水蛋白基因內含有1個 333 bp 的開放閱讀框，被2個內含子隔斷。目前為止在GenBank EMBL等分子生物學數據庫中注冊了大約70多個疏水蛋白基因。Peas等[26]從處于營養生長的P.ostreatus菌株中獲得3個不同的疏水蛋白基因Vmh1、Vmh2和Vmh3，其中Vmh1和Vmh2只在營養階段表達，Vmh3只在子實體階段表達，并且Vmh2基因與雙核菌絲生長速度相關的2個QTL緊密連鎖。在后繼的研究中，Peas等[27]在2個不同的糙皮側耳子實體中發現了2個特異疏水蛋白基因Fbh1和POH1，采用探針和RFLP分析Fbh1和POH1的基因結構，結果表明他們都為單拷貝基因、編碼序列大小、啟動子區域,前導肽、內含子、外顯子的數量和位置都有很高的相似性，核苷酸和氨基酸序列相似值分別為59%和66%。其中POH1具有2個等位基因Fbh1-1與Fbh1-2，其核苷酸序列具有96%的相似性，氨基酸序列具有99%的相似性。Fbh1-1、Fbh1-2與POH1的序列對比顯示分別有59%和58%的相似性。

4 展望

糙皮側耳是我國食用菌主要栽培種，但是遺傳研究進展緩慢，隨著糙皮側耳全基因組測序工作的展開和完成，將獲得更多的基因組分子結構信息。借助于新型分子生物學技術手段，糙皮側耳遺傳研究將為基因資源的開發利用奠定堅實的基礎。

[1]王賀祥.食用菌學[M].北京：中國農業大學出版社，2004.

[2]Khatun K,Mahtab H,Khanam PA,et al.Oyster mushroom reduced blood glucose and cholesterol in diabetic subjects[J].Mymensingh Medical Journal,2007,16(1):94-99.

[3]Vasudewa NS,Abeytunga DTU,Ratnasooriya WD.Antinociceptive activity ofPleurotusostreatus,an edible mushroom,in rats[J].Pharmaceutical Biology,2007,45(7):533-540.

[4]Wasser SP,Weis AL.Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms:a modern perspective[J].Critical Reviews in Immunology,1999,19(1):65-96.

[5]Larraya LM,Pérez G,Peas MM,et al.Molecular karyotype of the white rot fungusPleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(8):3413-3417.

[6]Wang Y,Zeng F,Hon CC,et al.The mitochondrial genome of the basidiomycete fungusPleurotusostreatus(oyster mushroom) [J].FEMS microbiology letters,2008,280(1):34-41.

[7]Liu L,DiGirolamo CM,Navarro PAAS,et al.Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells[J].Experimental Cell Research,2004,294(1):1-8.

[8]Barry JD,Ginger ML,Burton P,et al.Why are parasite contingency genes often associated with telomeres?[J].International Journal for Parasitology,2003,33(1):29-45.

[9]Pérez G,Pangilinan J,Pisabarro AG,et al.Telomere organization in the ligninolytic basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(5):1427-1436.

[10]Larraya LM,Pérez G,Ritter E,et al.Genetic linkage map of the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(12):5290-5300.

[11]Larraya LM,Idareta E,Arana D,et al.Quantitative trait loci controlling vegetative growth rate in the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(3):1109-1114.

[12]Larraya LM,Alfonso M,Pisabarro AG,et al.Mapping of genomic regions (quantitative trait loci) controlling production and quality in industrial cultures of the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(6):3617-3625.

[14]Santoyo F,González AE,Terrón MC,et al.Quantitative linkage mapping of lignin-degrading enzymatic activities inPleurotusostreatus[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,43(2):137-143.

[15]Freitag M,Morrel JJ.Changes in selected enzyme activities during growth of pure and mixed cultures of the white-rot decay fungusTrametesversicolorand the potential biocontrol fungusTrichodermaharzianum[J].Canadian Journal of Microbiology,1992,38(4):317-323.

[16]Orth AB,Royse DJ,Tien M.Ubiquity of lignin-degrading peroxidases among various wood-degrading fungi[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(12):4017-4023.

[17]Hatakka A.Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi:production and role from in lignin degradation[J].FEMS Microbiology Reviews,1994,13(2):125-135.

[18]Fernández-Fueyo E,Castanera R,Ruiz-Dueas FJ,et al.Ligninolytic peroxidase gene expression byPleurotusostreatus:differential regulation in lignocellulose medium and effect of temperature and pH[J].Fungal Genetics and Biology 2014,1087-1845.

[19]Caramelo L,Martinez,MJ,Martinez AT. A search for ligninolytic peroxidases in the fungus pleurotus eryngii involving alpha-keto-gamma-thiomethylbutyric acid and lignin model dimers[J]Applied and Environmental Microbiology,1999(4):916-922.

[20]Ruiz-Duenas FJ,Camarero S,Perez-Boada M,et al.A new versatile peroxidase fromPleurotusostreatus[J].Biochemical Society Transactions,2001,29(2):116-122.

[21]Pezzella C,Lettera V,Piscitelli A,et al.Transcriptional analysis ofPleurotusostreatuslaccase genes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(2):705-717.

[23]Palmieri G,Giardina P,Bianco C,et al.Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungusPleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(3):920-924.

[24]Wessels JGH,Asgiersdottir SA,Birkenkamp KU,et al.Genetic regulation of emergent growth in Schizophyllum commune[J].Canadian Journal of Botany,1995,73(S1):273-281.

[25]Wessels JGH.Hydrophobins:proteins that change the nature of the fungal surface[J].Advances in Microbial Physiology,1997,38(38):1-45.

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Research Advancement onPleurotusostreatusGenetics

XU Rong-rong1,2, BAU Tolger1

(1.Institute of Mycology, Jilin Agricultural University, ChangchunJilin130118; 2.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural SciencesKey Laboratory of Microbial Resources, Ministry of Agriculture, Beijing100081)

Pleurotusostreatuswas one of the major cultivated edible fungi in China. The genetic research progress onPleurotusostreatusin the aspects of genomics, QTL and main agronomic traits were described.

Genome; QTL; Lignin oxidase; Hydrophobic protein

注：不同意上述轉讓聲明的著作權人，在收到論文刊用通知5日內書面回復《中國食用菌》編輯部。

*項目來源：國家科技支撐計劃課題“食用菌新品種培育及制種關鍵技術研究”(2013BAD16B02)。

徐榮榮(1987-)，女，在讀碩士研究生，主要從事菌物藥學研究。E-mail:xurongrong555@163.com

**通信作者： 圖力古爾，教授，主要從事大型真菌資源多樣性研究及教學。E-mail:junwusuo@126.com

2014-07-25

S646.1

A

1003-8310(2014)05-0006-04