代謝組學(xué)分析技術(shù)在中藥毒理研究中的應(yīng)用△

楊中良，楊秀云，李劍，周怡，曲曉璐，劉衛(wèi)東

(1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200125； 2.上海市藍十字醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200125； 3.浙江省立同德醫(yī)院 內(nèi)科，浙江 杭州 310012)

綜 述

代謝組學(xué)分析技術(shù)在中藥毒理研究中的應(yīng)用△

楊中良1，2，楊秀云1*，李劍1，周怡1，曲曉璐1，2，劉衛(wèi)東1，2

(1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200125； 2.上海市藍十字醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200125； 3.浙江省立同德醫(yī)院 內(nèi)科，浙江 杭州 310012)

近年來，中藥毒性問題已經(jīng)越來越受到關(guān)注，代謝組學(xué)單一分析技術(shù)已用于中藥藥理和毒性反應(yīng)研究，且取得了一定的成果。但是，這些分析技術(shù)各有優(yōu)缺點。多分析技術(shù)可克服單一分析技術(shù)的部分缺點，如氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)代謝輪廓方法已經(jīng)揭開了馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎毒性機理。隨著代謝組學(xué)技術(shù)特別是多分析技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，將大大促進中藥毒理研究和安全評估工作，有助于中藥安全評估規(guī)范的構(gòu)建和國際標準指標的建立。

代謝組學(xué)；中藥；毒性；核磁共振；色譜法；質(zhì)譜法

近年來關(guān)于中藥毒性反應(yīng)事件時有報道，中藥面臨嚴峻挑戰(zhàn)[1]，有必要加強中藥毒理研究。但是中藥組分及其作用機理的復(fù)雜性使單純采用中藥安全評估方法研究顯得困難。代謝組學(xué)從代謝網(wǎng)絡(luò)終末癥狀全面反映生物體的功能，并分析由各種外界刺激引發(fā)的代謝變化[2]，與中醫(yī)的整體觀相一致，在中藥毒性研究中發(fā)揮越來越重要的作用。筆者對近年來廣泛用于中藥現(xiàn)代化研究中的各種代謝組學(xué)分析技術(shù)進行綜述，并對其在中藥毒理研究方面的應(yīng)用進行初步總結(jié)。

1 應(yīng)用于中藥現(xiàn)代研究中的代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)技術(shù)大致分為核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance，NMR)、色譜法(chromatograpy)、質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)。其中有許多分析技術(shù)已經(jīng)廣泛用于中藥現(xiàn)代化研究，如液相色譜法(liquid chromatography，LC)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)及毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)等。

1.1 NMR技術(shù)

自從1999年Nicholson引入NMR代謝組學(xué)技術(shù)以來[3]，NMR已經(jīng)成為代謝組學(xué)研究中最常用的一種技術(shù)，可提供代謝物分子結(jié)構(gòu)及分子動力學(xué)方面的詳細信息[4]。與MS和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)相比，NMR方法具有對樣本的非破壞性分析、高通量、不需太多樣本準備、分辨率高和重現(xiàn)性佳等優(yōu)點，但敏感度相對較低[5]。NMR方法適用于中藥等復(fù)雜代謝物成分的分析。

1.2 液相色譜法

1.2.1 高效液相色譜法 HPLC因具有操作簡便、敏感、價廉、不受樣本揮發(fā)性和穩(wěn)定性影響及分離能力強等優(yōu)點，廣泛用于生物樣本分析和中藥現(xiàn)代化研究[6]。但是，這種方法未與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合在一起，難以進行整體樣本的指紋分析。近年來，開發(fā)了一系列改良HPLC法，用于中藥指紋分析和中藥現(xiàn)代化研究，如毛細管HPLC(capillary HPLC，CHPLC)用于中藥活性成分的定量和定性檢測[7]，超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)用于識別中藥的活性成分[8]。

1.2.2 多維液相分離系統(tǒng) 諸如中草藥、尿液、血漿等復(fù)雜樣本不可能采用單一色譜柱來保留或分離所有種類的代謝物。采用2個及以上液相色譜分離模式的多維液相分離系統(tǒng)為一種有前景的方法，與單維HPLC相比，具有分離能力強、分辨力和敏感性高及檢測能力強等優(yōu)點。至今已經(jīng)有數(shù)個多維液相分離系統(tǒng)得到開發(fā)，并有效應(yīng)用于中藥混合物的分離和識別，如二維液相色譜法(LC×LC)用于補骨脂[9]和大黃[10]的分離等。

1.3 氣相色譜法

氣相色譜法(GC)主要用于中藥、尿液、血漿和血清等生物學(xué)樣本揮發(fā)性化合物的分析。Chen等[11]使用大劑量氫化考的松建立腎虛證大鼠模型，并將GC和多元統(tǒng)計技術(shù)用于數(shù)據(jù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以氫化考的松處理的大鼠尿液出現(xiàn)了明顯的生物化學(xué)變化。中醫(yī)學(xué)認為腎虛證為肥胖和糖尿病的早期表現(xiàn)，GC可用于肥胖和糖尿病等代謝綜合征的早期診斷。

1.4 毛細管電泳法

毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)也稱為高效液相毛細管電泳法(high performance HPCE)，于20世紀80年代初引入中國[12]，此后快速發(fā)展成為一種有效的分離和純化工具。與HPLC相比，HPCE具有高效、快速、溶劑和樣本消耗少、分離效率高和容易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點[13]，但HPCE總敏感性大約比HPLC低兩個數(shù)量級。盡管如此，HPCE在中草藥和中藥制劑的成分識別、分析及中藥指紋圖譜的建立[14]等方面仍具有光明的前景。

1.5 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析法(MS)常與其他分離技術(shù)聯(lián)合使用。MS檢測敏感性和選擇性高，可對多個分析物進行分析，提供代謝物結(jié)構(gòu)信息[15]，但具有侵襲性、樣本破壞性、樣本需水解或衍生預(yù)處理、檢測費用高及設(shè)備昂貴等缺點。但MS與LC聯(lián)用時能克服上述缺點，可用于中藥毒性研究，MS與GC聯(lián)用已經(jīng)成為識別和定量分析揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性化學(xué)成分的金標準[16]。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在中藥毒理研究中的應(yīng)用

近年來，國內(nèi)外有關(guān)中藥不良反應(yīng)的報道不斷增加[1，17]，中藥安全性問題更受到國際關(guān)注，代謝組學(xué)在中醫(yī)毒理學(xué)研究中已經(jīng)發(fā)揮越來越重要的作用。

2.1 單一分析技術(shù)

目前，普遍采用NMR、GC、MS和LC等單一分析技術(shù)對中藥作用靶器官、作用模式及機理等進行研究。至今，已完成對許多種中藥的代謝組學(xué)研究。

2.1.1 馬兜鈴酸 含有馬兜鈴酸毒性成分的中藥引起腎毒性是中藥毒性研究中最受關(guān)注的話題之一。Zhang等[18]通過NMR譜圖分析顯示，馬兜鈴酸可引起Wistar大鼠腎近曲小管和乳頭損害及輕度肝損害，重者可引起腎功能衰竭，即為馬兜鈴酸腎病[19]。通過對起病、發(fā)展及部分恢復(fù)的毒理過程進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸誘發(fā)的腎毒性為時間依賴性和劑量積聚過程。

2.1.2 朱砂和雄黃 Wei等[20]聯(lián)合應(yīng)用1H-NMR譜圖、肝腎組織病理學(xué)檢查和血清生化分析，分別研究朱砂和雄黃對大鼠的毒理機理，發(fā)現(xiàn)這兩種中藥呈現(xiàn)時間依賴形式，可干擾能量代謝、損傷氨基酸代謝及影響胃腸微生物種群環(huán)境。同時發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽可能是雄黃引起生物體氧化損傷的生物標志物。

2.1.3 烏頭 Li等[4]采用基于NMR的代謝組學(xué)方法研究黑參片即毛茛科烏頭外側(cè)根對大鼠代謝輪廓的作用，探索黑參片的毒性機制。實驗發(fā)現(xiàn)高劑量和中劑量組尿液牛磺酸水平在用藥早期即呈戲劇性下降，隨后牛磺酸水平逐漸上升，實驗結(jié)束時達到原來水平。該項研究中，大鼠尿液中牛磺酸水平下降，檸檬酸、葡萄糖和氨基酸水平的變化，提示黑參片有心臟毒性。

2.1.4 雷公藤 Li等[21]采用NMR、模式識別技術(shù)和主成分分析法(PCA)，研究口服雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠尿液代謝物的影響。結(jié)果顯示，用藥后尿中乙酸、甜菜堿和丙酮濃度升高，提示腎皮質(zhì)和腎乳頭受損傷。PCA分析顯示雷公藤處理組大鼠的代謝輪廓與對照組明顯不同，其與雷公藤內(nèi)酯醇的腎毒性緊密相關(guān)。

2.2 多分析技術(shù)

采用多種代謝組學(xué)分析技術(shù)并結(jié)合不同數(shù)據(jù)庫，全面了解中藥引起生物系統(tǒng)內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)變化，可以捕捉具有特殊生物學(xué)意義的內(nèi)源性代謝物。與單分析技術(shù)相比，多分析技術(shù)接近于所謂的“萬能分析”。

GC與MS聯(lián)合即GC-MS可使檢測敏感性提高，可以便捷獲取中藥干預(yù)后代謝成分相關(guān)信息，已廣泛應(yīng)用于中藥代謝指紋分析。但是，GC-MS分析技術(shù)存在耗時費勁和樣本浪費的問題[22]，且其所分析的代謝物須是揮發(fā)性，多數(shù)生物分子需要化學(xué)衍生化過程。與GC-MS不同，LC分析法排除了樣本揮發(fā)性和穩(wěn)定性的限制，分離能力更強，敏感性更高，但此法提供的信息比較有限，易受到樣本基質(zhì)的影響[23]。GC-MS與LC聯(lián)合應(yīng)用可充分利用這兩種技術(shù)的優(yōu)點，中藥毒性研究時可提供更全面的信息[5]。

Li等[24]聯(lián)合應(yīng)用NMR、GC和MS技術(shù)研究原發(fā)性高血壓陰虛陽亢證和陰陽兩虛證兩個亞型的代謝機理。研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝異常可能是兩型高血壓的主要共同通路，交感神經(jīng)系統(tǒng)激活在陰虛陽亢型中起重要作用，而低代謝率常發(fā)生于陰陽兩虛型高血壓中。Lu等[8]采用UPLC聯(lián)合MS技術(shù)，分析大劑量氫化考的松誘發(fā)的腎陽虛證代謝組學(xué)特征及骨碎補的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯丙胺、苯乙酰甘氨酸、N-琥珀酰鳥氨酸、L-脯氨酸、肌酐、馬尿酸和檸檬酸等代謝物發(fā)生了明顯的變化，提示能量代謝、氨基酸代謝和胃腸道微生物種群的代謝障礙，有利于進一步了解腎陽虛證及骨碎補的藥效機理。Ma等[25]采用UPLC-MS技術(shù)分析牽牛子處理的大鼠尿標本，結(jié)果提示牽牛子乙醇提取物可引起大鼠尿液8種內(nèi)源性代謝物發(fā)生顯著變化，可能通過干擾代謝通路潛在調(diào)節(jié)機制而引起腎功能損害。

Dai等[26]采用NMR聯(lián)合LC-二極管陣列-MS(LC-DAD-MS)分析法，對3個丹參品種的代謝組學(xué)進行分析，發(fā)現(xiàn)丹參代謝組中含有糖、氨基酸、羧酸等28個初級代謝物和4個次級酚類代謝物，其中N-乙酰谷氨酸、天冬氨酸和富馬酸首次在這種植物中發(fā)現(xiàn)。同一品種因產(chǎn)地不同其代謝組物也不同，說明丹參代謝組物對生長環(huán)境生態(tài)的依賴性，LC-MS聯(lián)合法有助于植物代謝組學(xué)的表型分析。

3 代謝組學(xué)的應(yīng)用前景

近年來，中藥毒性問題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，進而引發(fā)很多中藥相關(guān)的毒理研究。隨著中藥現(xiàn)代化的實施，亟需制定中藥安全評估規(guī)范。代謝組學(xué)為中藥安全評估提供了一種新型技術(shù)手段，但這些分析技術(shù)或多或少存在缺點和不足。隨著現(xiàn)有分析技術(shù)的開發(fā)和新型技術(shù)的出現(xiàn)，及公眾對其更加深入的了解，基于不同分析技術(shù)的代謝組學(xué)將在中藥毒性研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

[1] Laird AR，Ramchandani N，DeGoma EM，et al.Acute hepatitis associated with the use of an herbal supplement (Polygonum Multiflorum) mimicking iron-overload syndrome[J].J Clin Gastroenterol，2008，42(5)：861-862.

[2] Nicholson JK.Global systems biology，personalized medicine and molecular epidemiology[J].Mol Syst Biol，2006，2(7)：52-57.

[3] Nicholson JK，Lindon JC，Holmes E.Metabonomics：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29(11)：1181-1189.

[4] Li L，Sun B，Zhang Q，et al.Metabonomic study on the toxicity of Hei-Shun-pian，the processed lateral root of Aconitum carmichaelii Debx(Ranunculaceae)[J].J Ethnopharmacol，2008，116(11)：561-568.

[5] Lan K，Jia W.An Integrated Metabolomics and Pharmacokinetics Strategy for Multi-Component Drugs Evaluation[J].Current Drug Metabolism，2010，11(3)，105-114.

[6] Liang ZT，Leung NN，Chen HB，et al.Quality evaluation of various commercial specifications of Polygoni Multiflori Radix and its dregs by determination of active compounds[J].Chem Centr J，2012，6(1)：53.

[7] Zhao J，Yu QT，Li P，et al.Determination of nine active components in Radix Hedysari and Radix Astragali using capillary HPLC with diode array detection and MS detection[J].J Sep Sci，2008，31(2)：255-261.

[8] Lu X，Xiong Z，Li J，et al.Metabonomic study on ‘Kidney-Yang Deficiency syndrome’ and intervention effects of Rhizoma Drynariae extracts in rats using ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry[J].Talanta，2011，83(3)：700-708.

[9] Chen XG，Kong L，Su XY，et al.Integration of ion-exchange chromatography fractionation with reversed-phase liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometer and matrix-assisted laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry for isolation and identification of compounds in Psoralea corylifolia[J].J Chromatogr A，2005，1089(4)：87-100.

[10] Hu LH，Li X，F(xiàn)eng S，et al.Comprehensive two-dimensional HPLC to study the interaction of multiple components in Rheum palmatum L.with HSA by coupling a silica-bonded HSA column to a silica monolithic ODS column[J].J Sep Sci，2006，29(2)：881-888.

[11] Chen MJ，Zhao LP，Jia W.Metabonomic study on the biochemical profiles of a hydrocortisone-induced animal model[J].J Proteome Res，2005，4 (10)：2391-2396.

[12] Jorgenson JW，Lukacs KD.Capillary zone electrophoresis[J].Science，1983，222(7)：266-272.

[13] Ronda F，Rodríguez-Nogales JM，Sancho D，et al.Multivariate optimization of a capillary electrophoretic method for the separation of glutenins.Application to quantitative analysis of the endosperm storage proteins in wheat[J].Food Chem，2008，108 (2)：287-296.

[14] Yu Y，Yi ZB，Liang YZ.Validate antibacterial mode and find main bioactive components of traditional Chinese medicine Aquilegia oxysepala[J].Bioorgan Med Chem Lett，2007，17(2)：185-194.

[15] Ackermann BL，Hale JE，Duffin KL.The role of mass spectrometry in biomarker discovery and measurement[J].Curr Drug Metab，2006，7(5)：525-539.

[16] Ceglarek U，Leichtle A，Brügel M，et al.Challenges and developments in tandem mass spectrometry based clinical metabolomics[J].Mol Cell Endocrinol，2009，301 (8)：266-271.

[17] Gillerot G，Jadoul M，Arlt VM，et al.Aristolochic acid nephropathy in a Chinese patient：time to abandon the term ‘Chinese herbs nephropathy’?[J].Am J Kidney Dis，2001，38(3)：1-5.

[18] Zhang X，Wu H，Liao P，et al.NMR-based metabonomic study on the subacute toxicity of aristolochic acid in rats[J].Food Chem Toxicol，2006，44(7)：1006-1014.

[19] De Broe ME.Chinese herbs nephropathy and Balkan endemic nephropathy：toward a single entity aristolochic acid nephropathy[J].Kidney Internat，2012，81(6)，513-515.

[20] Wei L，Liao P，Wu H，et al.Metabolic profiling studies on the toxicological effects of realgar in rats by1H-NMR spectroscopy[J].Toxicol Appl Pharmacol，2009，234 (6)：314-325.

[21] Li JX，Hua J，He CC.Metabonomic study on the toxicity of traditional Chinese medicine (I)：renal toxicity of triptolide[J].Asia Pac Tradit Med，2007，3(8)：41-45.

[22] Pasikanti KK，Ho PC，Chan EC.Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids[J].J Chromatogr B，2008，871(2)：202-211.

[23] Liu XM，Zhang JS，Chen XG.Separation and determination of three water-soluble compounds inSalviamiltiorrhizaBunge and two related traditional medicinal preparations by flow injection-capillary electrophoresis[J].J Chromatogr B，2007，852 (11)：325-332.

[24] Li Y，Nie L，Jiang HQ.Metabonomics study of essential hypertension and its Chinese Medicine subtypes by using gas chromatography-mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy[J].Evid-Bas Complement Alternat Med，2013，Article ID 625906.

[25] Ma C，Bi K，Zhang M，et al.Metabonomic study of biochemical changes in the urine of morning glory seed treated rat[J].J Pharmaceut Biomed Anal，2010，53(3)：559-566.

[26] Dai H，Xiao CN，Liu HB，et al.Combined NMR and LC-DAD-MS analysis reveals comprehensive metabonomic variations for three phenotypic cultivars ofSalviaMiltiorrhizaBunge[J].J Proteom Res，2010，9(3)：1565-1578.

TheApplicationofMetabonomicsAnalyticalTechnologyintheToxicologicalResearchofTraditionalChineseMedicine

YANG Zhongliang1，2，YANG Xiuyun1*，LI Jian1，ZHOU Yi1，QU Xiaolu1，2，LIU Weidong1，2

(1.DepartmentofIntegrativeMedicine,ShanghaiPunanHospitalinPudongNewDistrict,Shanghai200125,China; 2.ShanghaiBlueCrossResearchInstituteofMedicalScience,Shanghai200125,China; 3.DepartmentofRespiratoryMedicine,TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310012,China)

In recent years，the toxicity of Traditional Chinese Medicine (TCM) has obtained increasing concern，while single technology of metabonomics has been applied in the research of TCM pharmocological effect and toxicological reaction and has already gained considerable achievements.But almost each of these metabonomic analytical tools has both drawbacks and advantages.Multiple analytical tools，such as metabonomic profile methods of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) have revealed the mechanism of renal toxicity induced by aristolochic acid.Further development and application of metabonomic tools，especially multi-analytical tools will greatly facilitate the toxicological study and safety evaluation of TCM，as well as the construction of TCM safety evaluation norms and international standard parameters.

Metabonomics；Traditional Chinese Medicine；Toxicity；Nuclear magnetic resonance；Chromatography；Mass spectrometry

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.019

2013-12-20)

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥開發(fā)研究基金課題(2011XY011)；2012年度上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會科研基金課題(ZXYQ-1235)

*

楊秀云，主任醫(yī)師，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療；E-mail：yangaxiu@tom.com