損傷性ED動物模型研究進展

崔志強宋魯杰綜述 盧洪凱王永傳審校

1. 山東省濰坊市中醫院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學附屬第六人民醫院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫院泌尿外科

·綜 述·

損傷性ED動物模型研究進展

崔志強1宋魯杰2綜述 盧洪凱3王永傳1審校

1. 山東省濰坊市中醫院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學附屬第六人民醫院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫院泌尿外科

近年來，前列腺根治術（RP）和根治性膀胱切除術、外傷所致的骨盆骨折和尿道斷裂（pelvic fracture urethral disruption, PFUD）以及骨盆和后尿道手術的患者不斷增多，其可對CN產生不同方式及程度的損傷，ED作為它們并發之一，發病率也不斷增加，國外文獻報道保留單側和雙側神經血管束（NVB）的RP后ED發病率分別為76%和53%[1]，PFUD患者ED發生率高達42%[2]，后尿道端端吻合術后ED的發生率為56%[3]。ED可對男性及其配偶的身體和心理健康產生重要的影響[4]，為此，許多科學家參與了對ED的研究。1863年，Eckhard[5]首次報道了盆腔神經在勃起功能中的重要性，提出了ED的基本概念，并增加了我們對ED病理生理學的認識[6]。通過對調節勃起的神經生理學的研究，發現許多激素和神經遞質對陰莖勃起起到重要作用[7]。雖然人類性功能復雜的屬性不可能被完全復制，但是動物模型是研究和評估ED的重要方式。現將損傷性ED動物模型的相關研究進展綜述如下。

一、動物的選擇

雖然狗、猴子、貓和兔子等大動物在早期（1960-1990）常被作為研究勃起功能的模型，但是嚙齒類動物已在很大程度上取代這些大的動物作為主要的動物模型，主要有以下幾個原因：第一是實驗費用方面，嚙齒類動物比大動物更經濟；第二是嚙齒類動物模型已被充分證明具有和人類相似的形態和功能；第三是手術操作和CN解剖方面，嚙齒動物模型很更簡單、容易；第四是由于嚙齒類動物壽命較短，在此期間內，可以通過檢測動物的生物反應評估疾病狀態和治療性干預的效果[8]。雖然嚙齒類動物模型在ED研究中有許多優點，但是它不能代表人類復雜的性行為和疾病。因為嚙齒類動物的壽命比較短，所以不允許長期研究不同ED模型類型。雄性大鼠的性反應主要依賴于嗅覺刺激，而人類更多地依賴于視覺和聽覺刺激。此外，嚙齒類動物不能完全理解陰莖勃起反應的含義，電刺激和成功插入雌性大鼠陰道分別引起的陰莖勃起也是有所不同的，而事實上，嚙齒類動物通過交配和電刺激引起的勃起反應與人類的也是有區別的。盡管如此，嚙齒類動物模型對人類仍具有較高的可預測性。鑒于上述種種原因，嚙齒類動物目前被作為ED研究的最常用的動物模型。

二、勃起反應的評價方法

海綿體內壓（ICP）檢測是陰莖勃起研究的重要方法，電刺激麻醉狀態大鼠的周圍神經，并測量其ICP的變化。阿樸嗎啡（APO）具有誘發勃起的藥理作用，雄性大鼠注射APO后可引起陰莖勃起反應[9]。Quinlan等[10]對CN損傷動物模型進一步研究后提出，通過測量ICP和平均動脈壓（MAP）的變化來檢測CN損傷對勃起反應的影響。動態海綿體造影和陰莖海綿體測壓提供了海綿體平滑肌功能評價的指標[11]。電刺激或化學刺激特定的大腦區域也可以引起陰莖勃起，內側視前區和下丘腦室旁為研究調節陰莖勃起行為的中樞神經系統提供了更高級的神經中心。口服、皮下、動脈內、靜脈內和海綿體等不同的給藥途徑已被用于研究它們對陰莖勃起的影響。

隨著蛋白質標記、免疫組化和Western blot分析等先進技術的發展，改進了對ED功能和形態學的評估，并增加了對ED病理生理學的理解[11-13]。動物模型和人類的海綿體組織通過原代細胞培養，可以增加我們對勃起功能細胞機制的了解[14]。在體外實驗中，利用重組載體敲除（KO）蛋白質或酶，以及利用間充質干細胞進行自體細胞培養，也增加對病理生理學的認識[15]。

三、損傷模型的分類

（一）CN損傷模型

Walsh和Donker[16]首次報道了骨盆手術對勃起神經通路的影響，前列腺癌根治術（RP）可以導致ED。有研究表明，RP后性功能恢復情況與術前有效的保護神經血管束有密切的聯系，盡管技術不斷的創新和進步，但是CN在保留神經（NS）的RP中仍然不可避免的被暴露和損傷，并導致ED。由于這個原因，許多科學家已經建立了多種CN損傷的動物模型，每種CN損傷模型都有其優點和缺點，實際應用中應根據需要選擇。

CN損傷模型的類型 Quinlan等[10]第一次利用嚙齒類動物模型研究陰莖勃起，利用電刺激誘導并測量大鼠的最大ICP，并建立了CN損傷模型的各種技術[17]。牽拉、擠壓、切斷、冷凍和切除CN等不同CN損傷方式已在各種動物模型中被廣泛應用[18]。

CN擠壓模型可由止血鉗、動脈夾等外科器械引起，造成CN機械壓迫，擠壓時間為15s～2min[19,20]。在CN擠壓模型中，利用止血鉗擠壓CN 2min，發現ICP降低，盆大神經節（MPG）和CN中的神經元型一氧化氮合酶（nNOS）陽性神經纖維的含量顯著減少[19]；Sezen等[20]在CN損傷研究中也發現了ICP降低和陰莖背神經中nNOS陽性神經纖維的含量減少。

冷凍是另一種CN損傷方式，利用干冰冷凍損傷CN，早期出現ICP降低和nNOS陽性神經纖維的含量減少，但是3個月后陰莖血流動力學和組織學恢復正常[21]。由于CN冷凍損傷保持相對完好的CN鞘，它在損傷的CN兩端提供了一個潛在的神經軸突再生的神經通路，從而恢復勃起功能。

游離性CN損傷的動物模型，從MPG到前列腺尖部游離CN，此過程中沒有CN擠壓和切斷，雖然早期發現ICP和nNOS陽性神經纖維的含量減少，但是8周后它們明顯恢復[22]，這種動物模型為我們解釋了CN游離導致CN損傷性ED的機制。

最近，朱建強等[23]在電凝損傷CN動物模型的研究中發現，ICP/MAP下降，陰莖背神經中神經絲蛋白的含量減少，并且海綿體組織纖維化，術后第1周電刺激CN后陰莖無勃起反應，ICP處于基線水平，雖然4周后ICP有了一定程度的提高，但仍顯著低于對照組。電凝損傷可以產生局部高溫，造成蛋白質變性、組織缺血及炎癥反應，對CN產生嚴重的損傷，導致ED。

CN切斷和切除是比較嚴重的CN損傷模型，CN切斷損傷使用剪刀直接切斷CN[24]，而CN切除損傷需要切除一段CN[25]，從理論上講，CN切除比CN切斷對勃起功能的影響更嚴重。CN鞘連續性中斷，缺乏神經再生軸突到達靶組織的神經通路，并導致不可逆的損害。此外，CN鞘損傷還可以導致陰莖平滑肌細胞凋亡，并引起靜脈閉塞性陰莖勃起功能障礙。

1. 單側CN損傷：Carrier等[26]發現單側CN損傷與雙側CN損傷相比，6個月后前者nNOS陽性神經纖維的含量更多，ICP數值更高，勃起反應更好。連續的神經纖維可以合成神經營養因子，并維持其支配器官的結構和功能[27]，在CN擠壓和CN冷凍動物模型中也發現CN損傷后軸突再生的現象[20,21]。然而，單側CN切斷模型中對側CN未損傷，可能會對損傷側神經的再生和恢復產生影響，并混淆實驗結果。

2. 雙側CN損傷：相比之下，雙側CN切斷后陰莖勃起功能迅速喪失，并且在整個實驗期間勃起功能完全喪失[10]。Zhang等[28]在雙側CN損傷模型中發現，nNOS陽性神經纖維的含量在第3周時顯著減少，6月后神經仍未出現再生。CN切斷2周后海綿體平滑肌和內皮細胞的細胞凋亡的組織學表現是顯而易見的[29]，可能是由于調節平滑肌細胞凋亡的sonic hedgehog（SHH）減少造成的[30]。SHH被抑制之后陰莖海綿體平滑肌細胞凋亡增加12倍，SHH治療CN損傷的動物模型后，海綿體平滑肌未出現明顯損傷性變化。因此，CN切斷引起的ED，可能是由于神經破壞、內皮細胞和平滑肌功能障礙造成的。

Jin等[31]在CN損傷導致ED的動物模型中，進一步說明了陰莖血流動力學紊亂和海綿體超微結構改變，與對照組比較，ICP明顯降低，纖維化因子表達增強，凋亡細胞和磷酸化Smad2陽性的海綿體內皮細胞及平滑肌細胞數目增加，CN擠壓造成勃起反應持續4W減弱，CN切斷引起的ED持續12W。

3. 轉基因CN損傷模型：NOS和一氧化氮（NO）在陰莖勃起過程中起到重要作用。目前，研究發現NO是激活NOS的重要因素，nNOS和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）對誘導型一氧化氮合酶（iNOS）具有重要作用。有研究認為nNOS通過激活中樞和外周系統，在勃起反應的起始階段起到重要作用，而eNOS促進血液流入海綿體竇，引起陰莖勃起[32]。基因工程小鼠缺乏nNOS和eNOS，ICP明顯降低，西地那非對nNOS基因KO小鼠增加勃起反應的作用減弱[33]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）轉基因小鼠出現自然勃起數目增加，并且膠原蛋白和彈性蛋白的表達也增加[34]。TNF-α是一個促炎細胞因子，可以抑制eNOS表達，TNF-α基因KO小鼠的eNOS表達增強，有利于陰莖勃起。

最近研究認為，iNOS具有防止組織纖維化和平滑肌細胞凋亡的內源性防御機制。Ferrini等[35]發現iNOS可以降低體內組織的纖維化，并維持NO的藥理學水平。在iNOS基因KO小鼠中，體內海綿體平滑肌/膠原的比例和平滑肌含量減少，這與ED動物模型中的結果一致。

（二）動脈結扎模型

陰莖動脈供血不足已被證明是ED的常見原因。髂內-陰部內-陰莖海綿體動脈系的動脈粥樣硬化或創傷性動脈閉塞性疾病可以導致陰莖血流灌注壓降低，改變陰莖血流動力學，導致ED的發生、發展。有研究表明，ED的出現早于冠心病[36]。結扎大鼠雙側髂內動脈可以直接引起ICP降低，但1個月后勃起明顯恢復[37]。免疫組化染色顯示陰莖背神經和海綿體神經中nNOS陽性神經纖維的含量減少，而聚合酶鏈反應（RT-PCR）提示初期的TGFβ-1表達上調。與其他器官缺血性變化一樣，也會出現成纖維細胞和肌成纖維細胞損傷、脂肪變性、膠原沉積和血竇塌陷等典型變化[38]。de Young等[39]也有類似的報道，海綿體組織中蛋白質表達和血管內皮的完整性發生改變，平滑肌纖維和血管內皮生長因子（VEGF）的表達減少，CN中nNOS陽性神經纖維的含量也顯著減少。

急性夾閉單側陰部內動脈或陰莖動脈可引起對側陰部內動脈血流代償性增加，只影響同側ICP，但雙側夾閉陰部內動脈引起雙側ICP顯著降低，嚴重影響勃起反應[40]。然而慢性陰部內動脈流入障礙對勃起功能影響較小，可能是由于陰莖周圍側枝循環建立緩解了這種缺血的改變。結扎髂內動脈后海綿體內注射VEGF，發現內皮細胞出現肥大和增生，血管生成作用顯著增強，可以促進勃起功能的恢復[41]。

（三）脊髓損傷模型

與CN損傷模型相比，脊髓損傷（SCI）和其他神經系統損傷的ED動物模型報道比較少。Allard和Edmunds等[42]在SCI動物模型中發現，可以出現類似射精節律性的球海綿體肌和陰莖勃起收縮。脊髓橫斷比未受損傷脊髓的勃起反應更強，并且肌電圖檢測發現球海綿體肌反射增強。Temeltas等[43]和Rivas等[44]在SCI模型中也發現了ICP的顯著增高。

四、結語

各種動物模型的開發和建立已在ED領域取得顯著進步。通過對勃起生理和再生醫學的研究，使我們對人類勃起功能障礙有了深刻的了解，也增加了對導致ED的病理生理學的理解，并可用于探索和測試新的治療ED的藥物和手術方式的效果。

雖然使用嚙齒類動物模型研究ED仍將是較為理想的動物模型選擇，但是我們需要認識到，嚙齒類動物的年齡、種類和品系可能會影響和干擾藥物的作用，從而對研究結果產生影響。開發更加符合人類病理生理學的損傷性ED動物模型將成為推動ED治療研究的重要工具。

致謝：本課題受國家自然科學基金資助項目（30901489）; 山東省科學技術發展計劃資助項目（2011GGH21813）

模型,動物; 勃起功能障礙

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（2013-11-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.019

R 698.1