HPV病毒庫(kù)與尖銳濕疣復(fù)發(fā)關(guān)系的研究

劉文慧 欒 紅夏超鋒

HPV病毒庫(kù)與尖銳濕疣復(fù)發(fā)關(guān)系的研究

劉文慧 欒 紅?夏超鋒

目的: 檢測(cè)尖銳濕疣(CA)患者及健康查體者宮頸或尿道口,肛周是否存在人乳頭瘤病毒,探討CA患者人乳頭瘤病毒亞臨床感染與復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法: 根據(jù)臨床及病理結(jié)果,收集215例女性CA患者、184例男性CA患者及125例健康查體者的宮頸/尿道口和肛周拭子標(biāo)本。基因芯片技術(shù)檢測(cè)HPV病毒及其亞型。結(jié)果: CA患者中,女性陽(yáng)性率為46.5%(100/215),正常對(duì)照組女性陽(yáng)性率為6.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。男性CA患者陽(yáng)性率為32.6%,正常對(duì)照組男性1.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。男性和女性CA高復(fù)發(fā)組均以HPV6/11型為主,低復(fù)發(fā)組以HPV16/18型為主。結(jié)論: CA患者存在HPV病毒感染的潛在病灶可能是CA復(fù)發(fā)的原因之一。

HPV病毒庫(kù)； 尖銳濕疣； 復(fù)發(fā)

尖銳濕疣(CA)是由人乳頭瘤病毒引起,易侵犯黏膜、表皮上皮細(xì)胞,產(chǎn)生包括良性病變(CA、癌前病變)、惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病。目前已鑒定的HPV約有100余種亞型,能引起CA的亞型主要為HPV6、11、16、18、31、33、35、45、51等30余種,根據(jù)致癌危險(xiǎn)性大小,將其分為高危型(如HPV16、18、31、33、35、39、45、51～53等)和低危型(如HPV6、11、42～44等)。本研究利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)女性CA患者外陰、宮頸、男性CA患者尿道口、肛周存在HPV病毒感染的潛在病灶,可能是CA復(fù)發(fā)的重要原因之一,為探討CA復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制及其治療提供新思路,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 所有CA病例均來(lái)自2009年1月至2011年1月我院皮膚科、婦科、肛腸科門(mén)診,女性215例,男性184例,均符合CA的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),隨訪(fǎng)1年,根據(jù)隨訪(fǎng)期間復(fù)發(fā)次數(shù)的不同,分為高復(fù)發(fā)組(≥5次)和低復(fù)發(fā)組(＜5次),高復(fù)發(fā)組年齡18～53歲,平均31.7±2.8歲,低復(fù)發(fā)組年齡21～59歲,平均35.8 ±3.1歲,所有患者均有CA的典型臨床表現(xiàn),醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性,并經(jīng)組織病理確診。

排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠及哺乳期婦女、嚴(yán)重心、肝及腎疾病或全身衰竭、腫瘤、自身免疫性疾病或合并其他性傳播疾病患者。1年內(nèi)未使用免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑。兩組年齡相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對(duì)照組:選擇女性健康查體者65名,男性健康查體者60名,為與CA患者性別、年齡、職業(yè)相匹配的健康查體志愿者。年齡18～51歲,平均29.6±3.3歲。與病例組年齡相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 外陰常規(guī)消毒后,2%利多卡因局部麻醉,用剪刀留取米粒大疣體,置于不同的微量離心管,－20℃凍存。窺陰器暴露宮頸或尿道口,棉拭子清除宮頸口或尿道口分泌物,取出宮頸刷置于宮頸口或尿道口,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)4～5周,將宮頸刷頭部放入洗脫管中,折斷宮頸刷柄,旋緊洗脫管蓋,做好標(biāo)本標(biāo)識(shí),直立放置洗脫管,－20℃凍存。將宮頸刷在洗脫管中充分漂洗后,把洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL微量離心管中,13 000 r/min離心10 min,棄去上清,保留管底的細(xì)胞塊。加入50μL裂解液懸浮沉淀,100℃水浴加熱10 min,13 000 r/min離心10 min,保留上清液待用。

1.2.2 檢測(cè)方法 人乳頭瘤病毒分型基因檢測(cè)試劑盒及相關(guān)試劑均由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。(1)PCR擴(kuò)增:取PCR反應(yīng)管做好標(biāo)記,5000 r/min離心2 min,而后加入已提取的待測(cè)樣品DNA 5μL,反應(yīng)總體系為25 μL。按以下條件擴(kuò)增:50℃,15 min；95℃,10 min；然后以94℃,30 s；42℃,90 s；72℃,30 s共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。(2)雜交:取15 m L塑料離心管,放入標(biāo)有患者編號(hào)的膜條,加入A液(2×SSC,0.1% SDS,pH 7.4)5 mL及所有PCR產(chǎn)物,混勻?qū)㈦x心管放入沸水浴中加熱10 min,放入雜交箱51℃雜交1 h。(3)洗膜:取出膜條,移至有預(yù)熱B液(0.5×SSC, 0.1%SDS,pH 7.4)的50 mL管中,于51℃輕搖洗滌15min。(4)顯色:用A液配制1∶2000的POD溶液,室溫輕搖浸泡30 min,棄去POD溶液。用A液室溫輕搖洗2次,每次5min。用C液(0.1moL檸檬酸鈉, pH 5.4)室溫洗膜1～2 min。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色15 min左右即可觀(guān)察結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判斷 倒去顯色液,用清水沖洗1次膜條,將膜條置于基因芯片閱讀儀上進(jìn)行結(jié)果掃描。膜條上探針按固定順序排列,有藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置即可斷定HPV的亞型。其中高危型包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4；低危型包括:HPV6、11、42、43、44。膜條在PC位點(diǎn)處有藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)視為有效；陰性對(duì)照膜條應(yīng)除PC點(diǎn)位置外無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn),否則有可能是發(fā)生污染或?qū)嶒?yàn)不成功。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 399例CA患者中,共有163例檢出HPV病毒,陽(yáng)性率為40.9%(163/399)。其中215例女性外陰CA患者中,共有100例宮頸中檢測(cè)出HPV病毒,陽(yáng)性率為46.5%(100/215),高復(fù)發(fā)組中67.3%(70/ 104)檢測(cè)出HPV病毒,低復(fù)發(fā)組中34.2%(38/111)檢測(cè)出HPV病毒；正常對(duì)照組女性6.2%(4/65)檢測(cè)出HPV病毒,女性高復(fù)發(fā)組陽(yáng)性率高于低復(fù)發(fā)組(χ2＝10.2,P＜0.05)和正常對(duì)照組(χ2＝50.0,P＜0.05)。184例男性CA患者中,共有63例尿道口中檢測(cè)出HPV病毒,陽(yáng)性率為32.6%(60/184),高復(fù)發(fā)組中43.3%(26/60)檢測(cè)出HPV病毒,低復(fù)發(fā)組中27.4% (34/124)檢測(cè)出HPV病毒,正常對(duì)照組男性1.7%(1/60)檢測(cè)出HPV病毒,高復(fù)發(fā)組陽(yáng)性率高于低復(fù)發(fā)組(χ2＝9.7,P＜0.05)和正常對(duì)照組(χ2＝32.1,P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 女性外陰CA患者共檢出15種HPV基因亞型,檢測(cè)結(jié)果與宮頸HPV亞型基本一致。高復(fù)發(fā)組以HPV6/11型為主(42/70,60.0%),低復(fù)發(fā)組以HPV16/18型為主(14/38,36.8%)。男性CA患者共檢出11種HPV基因亞型,檢測(cè)結(jié)果與尿道口HPV亞型基本一致。高復(fù)發(fā)組以HPV6/11型為主(14/ 26,53.8%),低復(fù)發(fā)組以HPV16/18型為主(12/34, 35.3%)。

3 討論

CA又稱(chēng)生殖器疣或性病疣,是由人乳頭瘤病毒引起的人生殖器部位及其附近表皮的一種良性乳頭瘤樣增生性疾病。人乳頭瘤病毒,是一種DNA病毒,具有高度的宿主和組織特異性,人類(lèi)是唯一的自然宿主,HPV病毒感染人體后,不經(jīng)血流擴(kuò)散,不產(chǎn)生系統(tǒng)感染,僅在局部引起亞臨床感染、潛伏感染及CA。2現(xiàn)已公認(rèn)HPV感染是宮頸癌的主要病因,其中高危型HPV持續(xù)感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌之間有著明確的相互關(guān)系。3HPV感染和與HPV有關(guān)的癌常是慢性免疫功能受抑制者的晚期并發(fā)癥。

本研究結(jié)果顯示,女性外陰CA患者宮頸可能存在潛在的HPV感染病灶,并且主要為HPV6/11型,而HPV6/11型復(fù)發(fā)率較16/18型高,說(shuō)明該組的高復(fù)發(fā)率可能是由于宮頸內(nèi)存在亞臨床的HPV感染灶所引起的,這些亞臨床感染灶中的HPV病毒完全可能通過(guò)月經(jīng)、外陰分泌物等途徑感染下游的外生殖器。而低復(fù)發(fā)組雖然復(fù)發(fā)率較低,但是由于其主要感染的是HPV16/18型,屬于易復(fù)發(fā)亞型,并且往往周期較長(zhǎng),因而,隨著時(shí)間的推移,該組的復(fù)發(fā)率可能會(huì)有進(jìn)一步的增加。男性CA患者尿道口也檢測(cè)出潛在的HPV病毒感染灶,這些亞臨床感染灶中的HPV病毒可能通過(guò)包皮過(guò)長(zhǎng)、分泌物等途徑感染到包皮及冠狀溝等處。值得注意的是,正常對(duì)照人群中也出現(xiàn)HPV感染,雖然經(jīng)體格檢查,并未發(fā)現(xiàn)有明顯癌腫的存在,并均否認(rèn)非婚性接觸史,仍需進(jìn)一步觀(guān)察。

臨床上治療CA并不困難,可各種治療方法都不能避免CA的復(fù)發(fā),且發(fā)病率逐年上升,CA復(fù)發(fā)的因素相當(dāng)復(fù)雜。要針對(duì)相關(guān)的原因進(jìn)行治療,首先采用適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǔ浞秩コR床可見(jiàn)的疣體,積極消除不利因素,提高機(jī)體免疫力,同時(shí)去除HPV亞臨床感染和隱性感染,對(duì)減少CA的復(fù)發(fā)有一定的重要意義,從而達(dá)到徹底治愈CA的目的。

1 Da Ros CT,Schmitt Cda S.Global epidemiology of sexually transmitted diseases.Asian JAndrol,2008,10:110－114.

2趙辨.臨床皮膚病學(xué).3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001. 535－536.

3 Che YM,Wang JB,Liu YH.Correlation between deoxy ribo nucleic acid loads of human papillomavirus and recurrence of condyloma taacuminata.Int JSTD AIDS,2005,16(9):605.

4馬彩玲,李軼杰,張富春,等.應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈方法檢測(cè)宮頸組織中人乳頭瘤病毒16E6基因.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004,84(6):469－473.

(收稿:2012－04－07)

Relationship between subclinical hum an papilomavirus infection and recurrence of condyloma acum inatum

LIUWen-hui,LUANHong,XIAChao-feng.LiaochengPeople'sHospi tal,252000

Objective:To investigate the relationship between subclinical human papilomavirus(HPV)infection and recurrence of condyloma acuminatum(CA).Methods:A total of 215 female patients,184 male patients with CA and 125 healthy persons were recruited in the study.The swab samples were collected from cervix urethra and perianal area；Gene chip technology was used to detect the presence of HPV virus and its subtypes.Results:While the positivity rate ofHPV in female patientswith CAwas46.5%(100/215),itwas 6.2%in the normal control group,with a significant difference.The positivity rate ofmale patients with CA was 32.6%,and 1.7%in normal controls,with a significant difference.The predominated sub－type of HPVwas HPV6/11 in higher recurrent groups both in male and female patients with CA and HPV16/18 type predominated in lower risk recurrent groups both inmale and female patients.Conclusion:The sub－clinical HPV infection may contribute to the recurrence of CA.

HPV infection；condyloma acuminatum；recurrence

山東省聊城市人民醫(yī)院,252000?通信作者