Nrf2-Keap1 信號通路與腦卒中

張 宇綜述，張 兵審校

腦卒中已成為世界上導致死亡和神經功能障礙的主要原因，嚴重危害人類健康。目前認為，缺血性腦組織損傷是由多種因素參與的復雜病理過程，其發病機制涉及腦組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸中毒、氧化應激損傷、炎癥反應等多個環節。目前最主要的治療措施是溶栓血運重建，矛盾的是，這會引起更嚴重的缺血-再灌注損傷。越來越多的證據證明刺激內源性抗氧化系統的表達將會是治療腦卒中的主要措施。其中以核因子E2 相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)為核心的Nrf2-Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)信號通路被認為是一種新型的抗氧化信號通路，對維持細胞內氧化還原穩態起重要的作用，其調控的一大批下游分子具有抗氧化應激、調節炎癥損傷、抗細胞凋亡、緩解鈣離子超載等多重功能。本文我們重點闡述Nrf2-Keap1 在腦卒中中的神經保護作用及其機制。

1 Nrf2-Keap1 信號通路分子基礎

1.1 Nrf2 的基本結構 Moi 等［1］最初發現Nrf2 是一種分子量為66000 的蛋白質，屬于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic region-leucine zipper)，即CNC 亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族。目前為止，該家族已被證實包括6 個成員:NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1 和Bach2。其中Nrf2 在機體中廣泛存在，對正常發育必不可少。Nrf2 分為6 個結構域，分別被命名為Neh1-6［2，3］。(1)Neh1 區:含有一個堿性亮氨酸拉鏈結構(basic leucine zipper，bZip)，必須與細胞核內小Maf 蛋白(包括MafG、MafK、MafF)結合形成異二聚體后才能識別并結合抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)，啟動目標基因轉錄;(2)Neh2 區:與胞漿蛋白Keap1 的Kelch 區相結合，負性調節Nrf2 的轉錄活性;(3)Neh3 區:由位于Nrf2 C-末端的16 個氨基酸組成，與活化轉錄密切相關;(4)Neh4 和Neh5 區:是2 個獨立的激活區，富含酸性氨基酸殘基，通過與共激活劑(如CBF)結合發揮強大的轉錄活性;(5)Neh6 區:富含絲氨酸殘基，已知功能甚少，可能與氧化應激細胞細胞核內Nrf2 的降解有關。

1.2 Keap1 的基本結構 Keapl 為一種錨定于胞漿肌動蛋白細胞骨架上的多肽類物質，其一級結構含有624 個氨基酸，由NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、和CTR5 個結構域組成［4］。其中，BTB/POZ 區介導蛋白的二聚化作用;C-末端DGR 區包含6 個雙鏈甘氨酸重復片段，為Keapl 與Neh2 的結合位點，可抑制Nrf2 轉位至細胞核內發揮作用［5］;IVR 富含半胱氨酸殘基，對親電子劑或氧化物高度敏感。親電子物質對半胱氨酸巰基修飾，可引起Keapl 的DGR 結構域構象發生改變，從而導致與其結合的Nrf2 釋放。

2 Nrf2-Keap1 信號通路在腦中的調節機制

研究證實在氧自由基(ROS)及親電子物質引起的內源性和外源性應激反應中，Nrf2-Keap1 途徑在其中起主要的調節作用。在生理條件下，Keap1 與Nrf2 結合，通過泛素-蛋白酶體途徑(the ubiquitin-proteasome pathway)可促進Nrf2 降解。Nrf2 半衰期小于20 min，這種迅速的更新使其在細胞質內保持低水平狀態［6］。當機體受到氧化應激或親電子物質的刺激時，Keap1 的半胱氨酸殘基被修飾，Nrf2 穩定性降低，導致Nrf2 與Keap1 解離，進行核轉移，與一種小Maf 核蛋白形成異二聚體，并與下游一系列解毒或抗氧化酶基因啟動子序列的特定DNA 序列—順式作用元件ARE 結合，從而激活這些酶的表達。在中樞神經系統中主要通過激活下游的血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)保護機體免受氧化活性物質(如ROS、RNS)及有害物質(如致癌物、藥物代謝活化產物等)的侵害［7］。其中與GSH 合成、代謝相關的酶類主要包括谷胱甘肽過氧化酶1(Gpx1)、谷胺酸半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-s-transferase，GST)等。

3 Nrf2-Keap1 信號通路在腦卒中的表達

永久性腦局部缺血后，對鼠大腦中Nrf2 的mRNA 和蛋白表達揭示，其表達呈時間依賴性，在3 h 時開始增加，24 h達到高峰，48 h、72 h 時下降，下降的原因可能是Keap1 激活下游的通路引起Nrf2 降解有關。增加的Nrf2 位于神經細胞、星形細胞的細胞核及細胞質［8］。Tanaka 等人［9］研究表明，在大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型中，Nrf2、Keap1 及下游抗氧化蛋白-GSH、HO-1 在梗死周圍區域和梗死區的表達不同。細胞質中Keap1 的表達在MCAO 后顯著下降，兩個區域中其水平在再灌后2 h～24 h 下降，72 h 后保持在低水平，相反Nrf2 在梗死周圍區域的表達于2 h 顯著增加，8 h 達到高峰，24 h～72 h 時下降，并且兩者的表達主要在神經細胞而非膠質細胞。梗死周圍區域Nrf2-Keap1 信號通路調控的下游抗氧化蛋白的水平缺血后24 h～72 h 才開始增加。值得注意的是，在缺血梗死區下游蛋白表達顯著減少，因此在梗死周圍區域，Nrf2-Keap1 通路的激活可能發揮更重要的內源性神經保護作用。這兩個研究的差異或許是因為所用模型的阻塞類型不同(永久性與短暫性)。在Nrf2-Keap1 信號通路表達的長期研究中進一步證實，Keap1 在8 h～3 d 的表達顯著減少，然而Nrf2 在ICH 后2 h 顯著增加，24 h 達到高峰，并且進一步發現ICH10 d 后，Keap1 和Nrf2 的水平幾乎達到正常水平，兩者表達部位與Tanaka 等人的研究一致。HO-1、GSH 和GST 基因水平在ICH 后早期階段就有不同程度的增加［10］。在采用原代培養星形膠質細胞建立的短暫性缺血再灌注體外模型中證實，缺血再灌注0.5 h 后，Nrf2 由胞漿轉移到胞核，隨著再灌注時間延長，胞漿和胞核內Nrf2 均呈下降趨勢。再灌注8 h 后，Nrf2 不再下降，表達水平趨于穩定［11］。以上研究中腦卒中后Nrf2 及Keap1 在神經血管系統的分布部位不同，還需要進一步的實驗來明確。另有研究表明MCAO 后4 h～72 h，Nrf2 和HO-1 的蛋白在梗死周圍區域的微血管的表達上調，HO-1 優先在血管周圍星形細胞表達［12］。

4 Nrf2-Keap1-HO-1 在腦卒中的作用

HO-1 是體內血紅素降解的催化酶，分解血紅素生成Fe2+、一氧化碳(CO)和膽綠素，膽綠素又在膽綠素還原酶的作用下轉變為膽紅素(BR)，在體內發揮著重要的器官保護作用［13］。HO-1 的具體作用機制還不明確，其可能通過以下兩種途徑起作用:(1)酶解可能引起氧化應激和炎癥反應的游離血紅素;(2)抗炎物質BR、CO 的產生。許多研究已經證明生理狀態下低水平的BR 通過清除ROS 發揮抗氧化應激的作用。HO-1 生成的CO 則參與凋亡、血管舒張和炎癥等的調節。

Wang 等人［14］發現將永久性腦缺血的小鼠，缺血后立即暴露于250 ppmCO18 h，梗阻面積顯著減少，并且Nrf2 與Keap1 的解離增加，促進Nrf2 核轉移，HO-1 的表達也隨之增加。而在Nrf2 基因敲除的小鼠中，這種保護作用消失。大鼠MCAO 模型研究證實，姜黃素［8］能夠激活Nrf2 通路引起Nrf2表達的增加，同時出現梗死體積縮小、腦水腫減輕和神經功能改善。上述作用可能是通過上調Nrf2，誘導下游抗氧化酶和解毒酶表達，從而發揮了神經保護作用。利用培養的原代皮質神經元細胞建立氧和葡萄糖剝奪/再氧合(OGD/R)模型，姜黃素在體內的研究進一步證明了其在腦缺血中的作用［15］。Li 等人［16］證實在小鼠MCAO 模型中，熊果酸能顯著改善神經功能，減少大腦梗死體積，并且脂質過氧化作用的產物丙二醛的含量，促炎因子TLR4 及NF-KB 的mRNA 和蛋白水平也降低。進一步證實Nrf2 和HO-1 水平提高，而在Nrf2 基因敲除鼠中有更嚴重的大腦損傷。乳果糖［17］和新橘皮苷(NH)［18］經口給予局部腦缺血的SD 大鼠后，能夠顯著改善神經評分，減小梗阻面積，減輕氧化應激損傷以及TUNEL 染色陽性細胞的數量。這些作用與Nrf2 及HO-1 的表達增多密切相關。另有研究表明促紅細胞生成素(EPO)通過增加Nrf2 及HO-1 的表達，減輕腦水含量及梗阻體積［19］。萊菔硫烷缺血前預處理激活Nrf2 通路能夠減輕血腦屏障損傷，改善神經缺陷［12］。以上研究提示通過誘導Nrf2的表達，激活Nrf2-Keap1-HO-1 途徑可能通過抗氧化應激、抗炎癥及抑制細胞凋亡作用，從而減輕腦卒中后的缺血再灌注損傷。

5 Nrf2-Keap1-GSH 在腦卒中的作用

GSH 是一種富含-SH，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的小分子三肽。GSH 是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，維持細胞內氧化還原穩態，可無需酶的參與，直接與過氧化物、NO、羥自由基等進行反應，從而把機體內有害物質排泄出體外，減少氧化應激對脂質、DNA 及蛋白質造成損傷，因此GSH 通常被認為是機體抗氧化能力的一個重要指標［20］。

Satoh 等人［21］在腦組織培養缺血模型中利用親電子試劑NEPP 激活Nrf2 通路，發現GSH 和HO-1 水平明顯上調，細胞凋亡數量明顯降低，證實了Nrf2 及下游表達基因的保護作用。SD 大鼠腦皮質原代星形細胞培養，建立OGD/R 模型，二咖啡酰奎寧酸(1，5-diCQA)預處理顯著抑制了細胞死亡，提高細胞活性，減少ROS 產量，并且使GCL 活性增加，促進了GSH 的從頭合成。進一步運用Western Blot 方法顯示1，5-diCQA 觸發了Nrf2 核轉移。而當用siRNA 轉染細胞抑制Nrf2 表達時，這些保護作用消失。作者推測在體內缺血/再灌注模型中，1，5-diCQA 通過激活Nrf2 途徑，上調GSH 合成，從而發揮抗氧化作用保護神經細胞［22］。

Karen 等人［23］利用體內OGD 模型和體外MCAO 模型發現，短暫的缺血預處理可引起腦缺血后Nrf2 目標基因的表達，并用real-time PCR 的方法證實與GSH 合成及利用有關的酶-GCL，谷氨酸鹽/胱氨酸反向轉運體(xCT)的表達也都增加。因此Nrf2 通過調控上述酶的表達來調節細胞內GSH含量，從而保護神經細胞。Nrf2-Keap1-GSH 通路對缺血再灌注和其它物質引起的氧化應激損傷都有保護作用。Burdo 等人［24］證實黃酮類化合物非瑟酮可以抵抗過氧亞磷酸鹽引起的神經細胞氧化應激損傷，并且使Nrf2 的表達上調，GSH 合成的限速酶GCL 的含量增加。而加入GSH 合成抑制劑BSO后，神經保護作用消失。因此非瑟酮可以通過激活Nrf2 途徑增加GSH 含量，增強細胞活性。另有研究發現，轉染Nrf2 質粒的NRK-52E 細胞在氧化應激損傷時，GSH 表達明顯高于對照組，并且應用基因沉默技術敲除Nrf2 基因后，NRK-52E細胞的GSH 表達與對照組相比明顯降低，細胞存活率降低［25］。

6 展 望

目前Nrf2 在中樞神經系統的研究已成為研究熱點，眾多的研究已經表明，Nrf2-Keap1 信號通路在腦卒中中可能是通過激活下游HO-1 及GSH 的表達發揮抗氧化應激、抗炎癥、抗凋亡等作用，但其具體機制還有待進一步闡明。同時我們也要關注Nrf2 持續激活可能帶來的不利后果如癌癥、動脈硬化等。雖然現在發現很多Nrf2 激動劑，但是這些物質能否應用于臨床仍是未來研究面臨的一大挑戰。隨著研究的深入，Nrf2-Keap1 將為腦卒中患者的治療提供新的思路。

［1］Moi P，Chan K，Asunis I，et al.Isolation of NF-E2-related factors 2(Nrf2)，a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control regions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(21):9926－9930.

［2］Takagi Y，Kobayashi M，Li L，et al.MafT，a new member of the small Maf protein family in zebrafish［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(1):62－69.

［3］Nioi P，Nguyen T，Sherratt PJ，et al.The carboxy-termainal Neh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Biol，2005，25(24):10895－10906.

［4］Uruno A，Motohashi H.The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for electrophiles［J］.Nitric Oxide，2011，25(2):153－160.

［5］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，et al.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(7):2046－2051.

［6］Kansanen E，Kuosmanen SM，Leinonen H，et al.The Keap1-Nrf2 pathway:Mechanisms of activation and dysregulation in cancer［J］.Redox Biol，2013，18(1):45－49.

［7］Taquchi K，Motohashi H，Yamamoto M.Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution［J］.Genes Cells，2011，16(2):123－140.

［8］Yang C，Zhang X，Fan H，et al.Curcumin upregulates transcription factor Nrf2，HO-1 expression and protects rat brains against focal ischemia［J］.Brain Res，2009，1282:133－141.

［9］Tanaka N，Ikeda Y，Ohta Y，et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Brain Res，2011，1370:246－253.

［10］Shang H，Yang D，Zhang W，et al.Time course of Keap1-Nrf2 pathway expression after experimental intracerebral haemorrhage:correlation with brain oedema and neurological deficit［J］.Free Radic Res，2013，47(5):368－375.

［11］張 瑩，盧 藝，曹 旭，等.Nrf2 在短暫性缺血再灌注大鼠星形膠質細胞模型中的表達變化及其意義［J］.中風與神經疾病雜志，2010，27(5):388－391.

［12］Alfieri A，Srivastava S，Siow RC，et al.Sulforaphane preconditioning of the Nrf2/HO-1 defense pathway protects the cerebral vasculature against blood-brain barrier disruption and neurological deficits in stroke［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:1012－1022.

［13］Paine A，Eiz-Vesper B，Blasczyk R，et al.Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential［J］.Biochem Pharmacol，2010，80(12):1895－1903.

［14］Wang B，Cao W，Biswal S，et al.Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2011，42(9):2605－2610.

［15］Wu J，Li Q，Wang X，et al.Neuroprotection by curcumin in ischemic brain injury involves the Akt/Nrf2 pathway［J］.PLoS One，2013，8(3):59843.

［16］Li L，Zhang X，Cui L，et al.Ursolic acid promotes the neuro-protection by activating Nrf2 pathway after cerebral ischemia in mice［J］.Brain Res，2013，1497:32－39.

［17］Zhai X，Chen X，Shi J，et al.Lactulose ameliorates cerebral ischemiareperfusion injury in rats by inducing hydrogen by activating Nrf2 expression［J］.Free Radic Biol Med，2013，65:731－741.

［18］Wang JJ，Cui P.Neohesperidin attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury via inhibiting the apoptotic pathway and activating the Akt/Nrf2/HO-1 pathway［J］.J Asian Nat Prod Res，2013，15(9):1023－1037.

［19］Meng H，Guo J，Wang H，et al.Erythropoietin activates Keap1-Nrf2/ARE pathway in rat brain after ischemia［J］.Int J Neurosci，2013.

［20］Gebicki JM，Nauser T，Domazou A，et al.Reduction of protein radicals by GSH and ascorbate:potential biological significance［J］.Amino Acids，2010，39(5):1131－1137.

［21］Satoh T，Okamoto SI，Cui J，et al.Activation of the Keap1/Nrf2 pathway for neuroprotection by electrophilic phase II inducers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(3):768－773.

［22］Cao X，Xiao H，Zhang Y，et al.1，5-Dicaffeoylquinic acid-mediated glutathione synthesis through activation of Nrf2 protects against OGD/reperfusion-induced oxidative stress in astrocytes［J］.Brain Res，2010，1347:142－148.

［23］Bell KF，Fowler JH，Al-Mubarak B，et al.Activation of Nrf2-regulated glutathione pathway genes by ischemic preconditioning［J］.Oxid Med Cell Longev，2011，2011:689524.

［24］Burdo J，Schubert D，Maher P，et al.Glutathione production is regulated via distinct pathways in stressed and non-stressed cortical neurons［J］.Brain Res，2008，1189:12－22.

［25］Li J，Jin J，Li M，et al.Role of Nrf2 in protection against triptolideinduced toxicity in rat kidney cells［J］.Toxicol Lett，2012，213(2):194－202.