經皮三叉神經慢性電刺激對慢性癲癇大鼠海馬和皮層內VGLUT1 表達的影響

賀慧艷，左 健，王倩倩，2，尹 娜，3，劉益民，王 玉

近年來，顱神經電刺激治療癲癇和抑郁障礙等中樞神經系統疾病受到了很多學者的重視，其中三叉神經電刺激(trigeminal nerve stimulation，TNS)對癲癇的治療作用已在癲癇患者和動物模型中得到證實［1，2］。本研究小組前期通過TNS 預處理大鼠，發現其癲癇發作程度明顯低于對照組［3］，進一步驗證了TNS 具有顯著的抗癲癇作用，這為臨床癲癇的治療提供了一種新技術，但到目前為止尚無關于TNS抗癲癇作用機制的研究報道。興奮性和抑制性神經傳遞的失衡是癲癇發作的核心機制［4］，興奮性氨基酸谷氨酸經特異性囊泡型轉運體轉運到突觸囊泡內，再經胞吐作用釋放至突觸間隙，進而引起突觸后神經元發生相應的改變［5］。本實驗中，我們用囊泡型谷氨酸轉運體-1(vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1)特異性標記谷氨酸能神經元突觸囊泡［6］，通過腹腔注射匹羅卡品(Pilo)誘導慢性癲癇大鼠模型，并對其進行慢性周期性經皮三叉神經電刺激，觀察經皮三叉神經慢性電刺激對慢性癲癇大鼠海馬和皮層內VGLUT1 表達的影響，探討TNS 干預慢性癲癇形成的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 選用成年健康雄性SD大鼠150 只，普通級，體重200±20 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，置于自由飲水進食、晝夜均衡、溫度20 ℃～25 ℃、濕度50%的環境中，喂養1 w以適應環境。

1.2 癲癇模型的建立 隨機選用100 只大鼠腹腔注射(ip)東莨菪堿(1 mg/kg)以拮抗匹羅卡品的外周膽堿能反應，30 min 后以匹羅卡品(360 mg/kg，美國Sigma 公司)腹腔注射誘導癲癇持續狀態(SE)。大鼠行為學觀察根據我們修改后的Racine5級評價標準［7］。Ⅰ級:出現面部抽搐，鼻毛抽動，前爪抓耳及咀嚼動作;Ⅱ級:出現點頭運動，一側前肢陣攣;Ⅲ級:出現肢體陣攣和輕微的身體抽搐;Ⅳ級:肢體陣攣，甩尾，牙關緊閉，全身抽搐;Ⅴ級:全身陣攣，失去平衡，跌倒并全身僵直。本研究以發作達到Ⅲ級或Ⅲ級以上癇性發作且持續時間超過30 min為誘導癲癇持續狀態成功的標準，對于沒有達到該標準的大鼠，每30 min 追加匹羅卡品(30 mg/kg)直至達到標準。SE 大鼠自出現Ⅲ級或Ⅲ級以上癇性發作1 h 后，給予地西泮(10mg/kg，ip)以終止發作，隨后將SE 大鼠隨機分為模型組(Pilo 組，n=50)和經皮三叉神經慢性電刺激組(TNS 組，n=50)，正常對照組(n=50)給予同劑量的生理鹽水腹腔注射;各組又隨機分為24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 5個亞組，每亞組10 只大鼠。

1.3 經皮三叉神經電刺激 參照我們以前的方法［3］對TNS 組大鼠進行經皮三叉神經電刺激(北京博洋生物器械有限公司KD-2A 型經皮電刺激儀)，簡述如下:將經10%水合氯醛(0.3 ml/kg，ip)麻醉后的大鼠俯臥固定，把兩個膜式電極對稱放置于三叉神經分支-眶上神經分布區域，即眼眶上方約1 cm、中內1/3 交界處，外接經皮電刺激儀;設置刺激參數:頻率140 HZ、電流10 mA、脈寬0.5 ms、正相脈沖，每次刺激30 s 后間歇5 min，每天連續刺激2 h，持續刺激一個月。正常對照組和Pilo 組大鼠的各刺激參數均設置為0，其余操作同TNS 組;各組操作均在固定時間段進行。

1.4 取材 實驗動物分別在刺激結束后24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 行斷頭取腦，每組每個時點大鼠數量為10 只，其中5 只用于免疫熒光雙標，另5 只用于Western blot 半定量分析。用于免疫熒光雙標的大鼠取材:10%水合氯醛(0.35 ml/kg，ip)麻醉后固定大鼠，開胸經左心室行升主動脈插管，先以0.9%生理鹽水100 ml 快速灌注以沖凈腦內血液，接著用4%多聚甲醛100 ml 先快后慢灌注固定全身，直至出現全身僵硬、尾巴僵直。快速斷頭取腦并于4%多聚甲醛中固定過夜，PBS 清洗后在30%蔗糖中脫水至組織塊沉底，以OCT 包埋后行冰凍切片，冠狀面連續切片以觀察海馬和皮層，冰凍切片厚約10 μm。用于Western blot 的大鼠取材:大鼠經上述方法沖凈腦內血液后，無需4%多聚甲醛灌注固定，快速斷頭取腦，迅速冰上分離皮層和海馬，二者分別儲存于相應凍存管中，－80 ℃冰箱保存以備Western blot 半定量分析。

1.5 免疫熒光雙標觀察皮層和海馬內VGLUT1 的變化 將新鮮冰凍切片用4 ℃純丙酮中固定、0.3%Triton X-100 通透、5%BSA 封閉后加一抗:豚鼠抗VGLUT1(1∶1000，Millipore)和兔抗MAP2(1∶200，Millipore)，室溫下孵育1 h、4 ℃孵育過夜，PBS 漂后在避光條件下加入熒光標記二抗即山羊抗豚鼠TRITC(1∶500，ImmunoReagents)和驢抗兔DyLight488(1∶200，EarthOx)，37 ℃避光孵育1 h，然后PBS 漂洗、抗熒光淬滅封片液封片。陰性對照分別以PBS 代替相應一抗，其余操作同上。在熒光顯微鏡(Olympus IX71)下觀察，采用同一曝光度分別對每張切片進行拍照，用Image Pro Plus6.0軟件進行圖像分析，分別計數海馬和皮層平均每個神經元胞體陽性表達數、平均熒光強度。

1.6 Western blot 檢測皮層和海馬內VGLUT1的表達情況 以蛋白裂解液(含1 mmol PMSF)提取組織總蛋白，經BCA 法蛋白定量后加入2×SDS 上樣緩沖液，沸水浴10 min 變性，樣本(30 μg)經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經電轉膜儀轉印蛋白至PVDF 膜，用含5%(w/v)脫脂奶粉的洗脫緩沖液室溫封閉1 h，加入一抗豚鼠抗VGLUT1(1∶5000)和小鼠抗β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液清洗后加入HRP 標記的二抗(1∶10000)，37 ℃孵育1 h;TBST 緩沖液清洗、ECL 化學發光，曝光后顯影、定影。以β-actin 作為內參照物，掃描并用Quantity one 4.62 軟件進行圖像分析，測量相對光密度值(relative optical density，ROD)，計算相對表達量。

2 結果

2.1 海馬內VGLUT1 的免疫熒光結果 正常對照組大鼠海馬內VGLUT1 有廣泛表達，齒狀回門區和CA3區的表達量較多，錐體細胞層和齒狀回的顆粒細胞層表達量較少。Pilo 組大鼠海馬內，VGLUT1 表達量較正常對照組明顯增多，平均熒光強度明顯增強，尤以CA3區、齒狀回門區和內分子層變化最為明顯，錐體細胞層和齒狀回的顆粒細胞層表達量也明顯增多，呈先上升后下降的趨勢，于72 h 左右達到高峰。以CA1區錐體細胞層VGLUT1的表達變化為例:Pilo 組與TNS 組較正常對照組在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 時VGLUT1 表達均明顯增多。與Pilo 組相比，TNS 組平均每個神經元胞體VGLUT1 陽性表達數及平均熒光強度在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2 皮層內VGLUT1 的免疫熒光結果 在正常對照組大鼠的皮層中VGLUT1 有基礎表達，表達量較少，主要集中在神經元胞體和突起部位。Pilo組與TNS 組大鼠的皮層中VGLUT1 的表達較正常對照組明顯增多，均呈上升的趨勢，在72 h 左右達到高峰隨后逐漸下降。與Pilo 組相比，TNS 組皮層內VGLUT1 的表達在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。皮層內平均每個神經元胞體VGLUT1 陽性表達情況在相應時間點與上述結果并不完全一致，主要表現為在14 d 和28 d 時，TNS 組與Pilo 組相比差異仍有顯著統計學意義(P＜0.01)，我們推斷這可能是由分布在非胞體部位的VGLUT1 的表達發生了變化所致。

2.3 海馬和皮層內VGLUT1 的半定量分析(Western blot)VGLUT1 在海馬和皮層內的Western blot 分析結果與免疫熒光相似，Pilo 組與TNS 組大鼠海馬和皮層內VGLUT1 的相對表達量在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 時均高于相應時間點正常對照組(P＜0.05，P＜0.01)。與Pilo 組相比，TNS 組VGLUT1 相對表達量在24 h 明顯增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 時明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。海馬內VGLUT1 的相對表達量在28 d 時、皮層內在14 d 和28 d 時均降至正常水平(P＞0.05)。

3 討論

腦內興奮-抑制平衡是保證腦穩態的重要條件，其復雜的調節機制是通過各種神經遞質介導的，谷氨酸是哺乳動物腦內主要的興奮性神經遞質，它經VGLUT1 特異地轉運入突觸囊泡，再經胞吐作用釋放至突觸間隙，進而引起突觸后神經元發生相應的改變［5，6］。VGLUT1 的表達水平通過影響谷氨酸能突觸囊泡的量子大小而影響谷氨酸在生理或病理狀態下的釋放進而影響突觸的可塑性［7，8］。Boulland JL 等人［9］發現在匹羅卡品誘導的癲癇大鼠模型的慢性期，海馬CA1-CA3區VGLUT1 表達明顯增多，且含VGLUT1 的突觸終端也明顯增多。與此一致，我們發現慢性癲癇大鼠模型的海馬和皮層內VGLUT1 的表達均較正常對照組顯著增加，我們推斷慢性癲癇大鼠模型海馬和皮層內谷氨酸能神經元興奮性突觸傳遞增強。

Navarro Mora G 等［10］發現，經匹羅卡品誘導的大鼠即使在急性期沒有出現癲癇持續狀態后期也可觀察到癲癇自發性反復發作，這可能是匹羅卡品誘導一次癲癇發作后腦內發生一系列的可塑性改變而致腦興奮性增高，最終發展成為具有自發性反復發作特點的慢性癲癇模型;在一次SE 后予以盡早的干預有可能改變這一發展過程從而起到減少癲癇發作的作用。三叉神經的多種刺激形式均可通過丘腦激活包括顳葉皮層、海馬等感覺和運動皮層在內的廣泛大腦區域［11～13］，有報道高頻刺激視皮質和海馬等處的神經元能夠引起細胞興奮性增加，興奮性神經遞質傳遞增強，使中間神經元活性代償性增強，抑制性信號傳導增強，進而使釋放至突觸間隙的抑制性神經遞質增多;后者也可反作用于主體神經元，抑制其興奮性，從而保持大腦自身的興奮性和抑制性信號傳導處于一種動態平衡狀態，即大腦的自身穩態調節機制，而長期接受興奮性刺激產生的大腦自身穩態調節的結果是神經元興奮性降低的可塑性改變［14］。本文作者Wang 等人在培養的海馬腦片上慢性阻斷或減少興奮性沖動傳導，發現海馬興奮性的增高易于誘發癇性放電，且起抑制作用的中間神經元的存活和其內的GAD65/67 顯著減少［15］。本實驗中大鼠致SE 后予以經皮三叉神經電刺激處理一個月(這段時間正是慢性癲癇的形成過程)，我們發現TNS 刺激癲癇大鼠腦內VGLUT1 的表達較假刺激癲癇大鼠在TNS 終止后短時間內顯著增多，而在其后的較長時間則顯著減少，提示谷氨酸能神經元興奮性突觸傳遞先短時間內顯著增強后較長時間顯著減弱。我們推測經皮三叉神經慢性電刺激對癲癇形成過程中腦興奮性易感性的形成有干預作用，長期慢性皮層和海馬激活可能使皮層和海馬產生一系列興奮性適應性改變，從而提高了它們的興奮性閾值，即降低了它們的興奮性易感性。本研究小組在前期研究中發現經皮TNS 預處理的大鼠癲癇發作程度較對照組明顯減輕，推測這與海馬內GAD65/67 的表達量明顯增多有關［3］。因此，我們推斷經皮三叉神經慢性電刺激使腦的興奮性易感性降低、內源性抑制機制增強，從而減少癲癇發作。此外，三叉神經傳入纖維有部分終止于孤束核和藍斑核［1］，藍斑核在迷走神經電刺激抗癲癇的機制中起著非常重要的作用，刺激藍斑核能明顯減少驚厥發作［16］，而毀損藍斑核則可促進慢性癲癇的形成或加重癲癇的自發性反復發作［17］，因此，三叉神經電刺激的抗癲癇作用是否與藍斑核的信號傳導有關有待進一步研究。

綜上所述，在匹羅卡品誘導的慢性癲癇大鼠模型形成過程中，予以經皮三叉神經慢性電刺激處理降低了腦的興奮性易感性，其機制可能與腦內VGLUT1 的表達先增多后減少有關;關于三叉神經慢性電刺激抗癲癇的確切機制仍待進一步研究。

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