胚胎干細胞和誘導性多能干細胞體外分化成精子細胞的研究

李明穎 綜述 李永剛 審校

云南省第一人民醫院生殖遺傳一科（昆明 650032）

胚胎干細胞和誘導性多能干細胞體外分化成精子細胞的研究

李明穎 綜述 李永剛 審校

云南省第一人民醫院生殖遺傳一科（昆明 650032）

據世界衛生組織（WHO）統計，世界上有10%～l5%的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中由男性方面因素導致的不孕癥約占30%[1,2]，無精子癥在男性不育患者中的比例約為10%～15%。目前對于無精子癥病人的主要治療方法如下：（1）對于梗阻性無精子癥可以從睪丸組織獲得精子或者精子細胞，行單精子胸漿內注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）來治療。（2）對于先天性生殖異常或者后天環境、輻射、醫學治療等原因造成的永久性生殖異常，臨床上常推薦采用供精人工授精進行治療[3,4]，因而無法獲得含有自身遺傳物質的后代。原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）和胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs）以及胚胎生殖細胞（embryo germ cells, EGCs）相關，如果能體外培養得到生殖細胞，此類患者將有希望獲得擁有自己遺傳基因的后代。

ESCs是指在組織生殖層形成前，從早期胚胎中分離出的的具有多能性的干細胞系[5]。ESCs通常是從移植前的囊胚中獲得的，在體外合適環境中展示出無限的多能性。過去幾年的研究表明鼠源ESCs（mESCs）可以在體外發育成PGCs，并且在繼續培養中，可以偶然的形成早期精子細胞或者卵原細胞，卵原細胞可以形成卵泡或者卵巢類似結構以及卵子[6]。

誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是由體細胞誘導產生的多能性干細胞，同ESCs表現出相似的多能性水平。iPSCs不僅在形態、生長特性、干細胞標志物表達方面與ESCs非常相似，在克隆形成、基因表達、表觀遺傳、分化潛能等方面也與ESCs高度相似，體外可以形成3種生殖層細胞類型，注射體內后可以形成畸胎瘤。

一、生殖細胞發育過程

生殖細胞（Germ cells，GCs）來源于PGCs，將遺傳信息通過基因組帶給下一代。多數脊椎動物原腸胚期的原始生殖細胞分布于腸道、卵黃囊或尿囊基部的內胚層細胞間，在發育中沿腸壁遷移，進入背腸系膜，最終達到正在發育的生殖嵴處，并和生殖嵴的中胚層細胞共同組成睪丸或卵巢。許多年來，組織非特異性堿磷酸酶（TNAP）的活力被用于標記PGCs，及其最終進入性腺原基的生殖嵴的過程[7]。這種酶在PGCs、ESCs、EGCs和胚胎源腫瘤細胞中都有高表達，這些細胞都具有全能性。人類PGCs的遷移發生于孕5周到8周，而在很多個體中，PGCs在遷移到生殖嵴后會大量增加，最終成為不遷移的生殖母細胞[8]。男性中[4]，生殖母細胞被阻斷在有絲分裂G0期直至出生。出生后，靜止的細胞進入有絲分裂周期分化成精原細胞，之后分裂并分化成精母細胞，進而減數分裂成精子細胞，并發育成成熟精子。在睪丸中會保留一小群精原干細胞（spermatogonial stem cells, SSCs）。這些細胞會持續的進入減數分裂期并產生單倍體細胞。而在女性中，PGCs被阻斷在第一次減數分裂Ⅰ期。出生后，繼續減數分裂后被阻斷在減數分裂Ⅱ期直至排卵前[4,9]。

二、生殖細胞發育相關基因及其在ESCs和iPSCs誘導中的作用

體外分化生殖細胞的一個主要困難是缺乏合適的將生殖細胞從體細胞中區分出來的分子標志物。目前已知的生殖細胞發育相關基因闡述如下。

Blimp1：近期研究表明，早在受精后6.25d，Blimp1蛋白的表達可在少至6個外胚層細胞中檢測出來，作為生殖細胞的標志[8]。目前研究認為，Blimp1是胚胎中最早可以識別出PGCs的基因。小鼠中Blimp1的突變會導致PGCs數量的減少，以及正常遷移行為的缺失，而在很多個體中，PGCs在遷移到生殖嵴后會大量增加，最終成為不遷移的生殖母細胞。

BMP4、8b：在小鼠中，生殖細胞的形成由對胚外外胚層包括生長因子協同作用發出的信號做出的反應而誘導，尤其是BMP4和8b，兩者都是轉移生長因子βTGF-β亞家族的成員[10]。成熟BMP4蛋白結合在異源受體復合物和下游的Smad蛋白的二聚體，其信號也通過二者傳遞。BMP4、8b單獨是不能誘導PGCs從外胚層中培養出來，但結合后可以，提示各種BMPs的信號通路可以通過不同的受體復合物發生和BMP4非常相關的BMP2表達于PGCs形成時的內臟內胚層，并且BMP2的失活會導致PGCs數目的減少，揭示其在（至少在小鼠中）內臟內胚層PCGs發生中的作用[10,11]。

fragilis、Stella：干擾素誘導蛋白fragilis具有抗增殖作用，可以在PGCs中延長細胞周期。由于生殖細胞的命運早已被決定，fragilis在其中只有短暫的表達，但是該基因也在ESCs和EGCs中表達，提示其在全能性狀態中的作用。Stella在全能性發展中有類似的作用，并和染色體重塑或者RNA過程相關。其在卵子、移植前胚胎以及生殖細胞源腫瘤中都有表達[12]。

VASA：免疫組化分析表明，小鼠VASA同源基因（Mvh）蛋白特異的表達于遷移到生殖腺后的PGCs和經歷配子形成過程的生殖細胞中，直到減數分裂后期[13]，為生殖細胞標志基因。

Oct4 ：POU區域轉錄因子OCT4在囊胚內細胞團和ESCs中對于維持全能性很重要。研究表明，Oct4的缺失會導致細胞凋亡[14]。在人類胎兒組織，Oct4在遷移的PGCs中高表達，同時，在人類生殖細胞腫瘤和EG細胞中也高表達[15]。

c-Kit：酪氨酸激酶受體c-Kit及其配體干細胞因子（SCF），對兩性生殖中PGCs的維持是必不可少的。在成人睪丸，c-Kit受體在分化的精原細胞中重新表達，但在精原干細胞不表達，精原干細胞中，在促卵泡激素的刺激下，Sertoli細胞表達SCF[16]。

DAZL：DAZ基因在無精子癥中缺失，Y染色體DAZ基因缺失的男性只有極少或者沒有生殖細胞，提示他們在生殖細胞形成或者保持方面有缺陷。DAZ的同源基因DAZL（DAZ-Like）在不同種的生物中被發現，對于人類，不論男性女性，其生殖細胞發育過程中都需要該基因[9]。

視黃酸（RA）：RA基因是減數分裂的參與基因并控制男性或者女性表型的分化。低水平的RA會阻滯生殖細胞進入減數分裂，高水平會誘發減數分裂。一些研究表明，卵巢和睪丸有同樣的誘發減數分裂的信號系統但是調節時機不同。RA信號是卵巢中誘發生殖細胞進入減數分裂的關鍵的調節子，通過誘導生殖細胞特異基因Stra8的表達。相反，胎兒睪丸中，Cyp26b1蛋白的表達調節RA代謝成失活狀態，使該過程阻滯。出生后睪丸中，RA由靠近精原細胞的支持細胞產生并運輸，同發育的卵巢一樣，由于Stra8蛋白表達上調，誘發進入減數分裂[4]。

因此，Blimp1, Stella, fragilis, c-Kit, VASA（Mvh）和DAZL基因的表達在生殖細胞分化過程中起到很重要的作用，他們的表達是具有階段特異性的，因此可以在生殖細胞發育的不同階段提供可靠的識別。

精子在發生和分化過程中存在著階段特異性的標志分子，如多能型標志蛋白Nanog、Oct4、Sox2、GDP3[14,15]，PGCs/減數分裂前期標志蛋白Fragilis、Stella、Blimp1、c-Kit、HILI[8,10-12,16,17]，減數分裂各階段標志蛋白DAZL、VASA、CXCR4、PIWI1、UTF1、CDH、SCP3、Prot1、TP1[13,18,19]等，大多數用于PGCs的標志蛋白在ESCs中也存在，如Fragilis,Stella, DAZL, c-Kit等[20]。

研究表明，在培養液中加入重組BMP4有利于人類ESCs（hESCs）的獲得和維持，DAZL、VASA等的過表達可促進正在分化的hESCs/iPSCs形成PGCs[21]，同時，Toyooka等在模擬體內生殖細胞分化系統產生的擬胚體細胞中發現BMP4的表達，認為BMP4在ESCs到PGCs的分化中起到重要作用[22]；Eguizabal等在臍帶血和角化細胞誘導產生的ESCs和iPSCs細胞系中，均檢測到Oct4基因的表達，且生殖細胞標志基因VASA檢測為陰性。在加入RA誘導培養誘導分化后，Oct4基因表達下調，VASA表達上調[23]；Lu等認為，c-Kit可以在ESC功能性監測中作為標志物，其參與的酪氨酸激酶信號通路在維持ESC不分化狀態中起到重要作用[24]；Saiti等認為c-Kit在調節ESCs的生存和分化方面具有和在生殖細胞系中類似的作用[25]；Nayernia等在ESCs中利用RA誘導篩選出Stra8陽性細胞，在形成的擬胚體中檢測到Mvh基因的表達，并在之后形成的單倍體生殖細胞中檢測到Oct4、fragilis、Stella、Mvh、Dazl的表達，同時c-Kit表達增強[26]；Yang等研究表明RA在iPSCs分化成雄性生殖細胞的過程中起到減數分裂誘導因素的作用[27]。

三、體外培養ESCs、iPSCs及其分化為精子細胞的研究進展及存在問題

2004年，Clark等報道從hESCs形成的擬胚體中分化出表達VAS 和SCP3的GCs[20]；Payer使用Stella-GFP標記的mESCs培養表明，不同于Oct4和TNAP的均勻分布，ESCs會產生非常明確的Stella陽性的細胞群[28]。在一些細胞中會出現明顯的Oct4和Stella的重疊表達，表明有這種標志物結合的生殖細胞可能是生殖細胞類似的ESCs。這表明，可能可以在ESC培養系統加入誘導因子，形成干細胞微環境，進一步誘導生殖細胞的發育。維持這些復雜小環境的合適的生長因子和荷爾蒙微環境可能取決于培養系統的一些成分[9]；Geijsen等用帶有GFP的Oct4基因進行跟蹤，GFP標記的mESCs生成單倍體精子后，通過流式分離，行ICSI注射入卵子，可形成囊胚[29]；Toyooka等利用mESCs篩選出的Mvh陽性細胞研究體外生殖細胞的分化，將篩選出的細胞和雄性生殖腺細胞共移植入小鼠睪丸后檢測到有標記的精子形成[22]。Nayernia等利用傳統2階段培養系統從mESCs得到有類似尾部結構的雄性單倍體生殖細胞，并檢測到頂體的形成、核聚集的出現。將該細胞移植入生殖細胞缺失的小鼠睪丸后，在管腔中生成精子，行ICSI后形成胚胎移植后得到活產小鼠，并分析了在分化細胞中的一些印記基因的甲基化狀態，發現在小鼠中甲基化沒有正確的表現，大多數在一個月內死亡[26,30]。盡管如此，該結果仍表明從胚胎干細胞體外衍生的雄性配子可正常受精并發育成個體。在hESCs研究中，Aflatoonian等[19]發現hESCs在分化的擬胚體中檢測到成熟生殖細胞特異基因（VASA、Oct4、DAZL、PRM2、c-Kit、SCP3等）的表達。

在iPSCs研究方面，2006年，Takahashi等[31]通過在小鼠成纖維細胞用反轉錄病毒導入Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc4個基因成功獲得鼠源iPSCs（miPSCs）。2007年，Takahashi等和Yu等分別在人類成纖維細胞中使用同樣的4個基因或者Oct4、Sox2、Linm28、Nanog獲得人類iPSCs（hiPSCs）[32,33]。目前研究表明，人類、非人類靈長類動物和鼠的iPSCs都可以在體外分化出VASA和DAZL陽性的PGCs[34,35]。Hayashi等研究表明，iPSC在體外分化成PGCs類似的狀態，移植到不孕小鼠睪丸后，可以產生有功能的單倍體精子細胞[36]。Cai等體外加入RA誘導miPSC細胞分化成Oct4、c-Kit、Mvh陽性的PGCs類似細胞，將GFP標記的miPSCs和胎鼠睪丸細胞混合移植入雄性小鼠體內后，檢測到源于miPSCs的生精小管組織形成[37]。Yang等利用hiPSCs體外誘導分化產生雄性GCs，將其和睪丸細胞混合注射到小鼠背部皮膚后，可以重建生精小管[27]。然而，在其他哺乳動物中，PGCs恢復睪丸不育的功能極其有限。另外，睪丸功能環境也直接影響到移植后PGCs的發育結果，因而，對于睪丸環境完全失活的病人來說，這種PGCs移植的方法并不可行，最好的方法是iPSCs體外誘導生成精子后，行ICSI進行助孕治療。Easley等在體外從hiPGCs直接分化得到精子分化各階段的單倍體細胞，甚至得到圓形精子[38]。Eguizabal等在誘導產生的hiPSCs中，檢測到Sertoli細胞和Leydig細胞標志物陽性的細胞，提示初級睪丸位的形成，同時檢測到類似于睪丸中早期精原細胞、精原細胞和早期人類精子細胞標志物的表達分布（CD9+/CD49F++/CD90-），并通過FISH檢測到雄性單倍體細胞的形成[23]。

目前，hESCs的獲得有兩種途徑：（1）捐贈IVF胚胎發育成囊胚后，從內細胞團（inner cell mass, ICM）獲得ESCs；（2）通過體細胞核移植技術（somatic cell nuclear transfer, SCNT）獲得胚胎形成囊胚后，從ICM獲得ESCs。第一種方法仍然無法得到繼承了父本基因的后代，而第二種方法在人類疾病治療中由于倫理問題的考慮，不能予以實施，且在動物模型中的實驗表明，將自體體細胞核轉移到卵子中獲得無性生殖ES細胞的效率很低，約為3%～5%，產生定制配子的效率將更低[39]。hESCs在培養中，為了保持其不分化狀態，需要飼養層細胞和動物來源的培養成分，這些可能帶來病原體的交叉感染；其次，hESC在長時間培養中表現出基因組的不穩定性和無法預知的分化方向，可能會導致生理上的傷害或者群體中累計的基因突變[39]；在臨床應用中，由于用于男性不育后續治療上存在異體排斥的風險，需要患者長期進行免疫抑制劑的治療[40]。

相對于ESCs，iPSCs有著更多的優勢：iPSCs源于自體細胞，設計道德倫理方面的問題較少，并且可以用于構建病人特異性的細胞治療模型，在可能的后續應用治療中解決了異體排斥的安全問題。然而，在臨床應用中，iPSCs仍然存在一些問題：（1）iPSCs獲得效率低；（2）在誘導過程中對基因組的修飾可能會影響到細胞的重編程。最初的iPSCs是通過反轉病毒或者慢病毒載體導入特定基因獲得[32,33]，這種誘導因子的引入和對基因組的整合，可能導致細胞染色體的修飾，反轉病毒載體的引入，可能引起原癌基因的激活，這些給iPSCs的臨床應用帶來巨大的阻礙。近年來，大量的研究集中在如何在不引起基因組改變的條件下獲得iPSCs。隨著研究的深入，iPSCs的誘導因子從最初的4個逐步簡化至1個[41-44]，重編碼方法也從最初的反轉病毒載體介導，發展到后來的腺病毒介導、DNA載體介導、mRNA轉染、重組蛋白轉導等方法[45-48]。較于病毒載體介導方法，DNA載體介導雖然相對安全簡便，但仍存在基因組重組風險，且重編碼的效率極低；mRNA的應用可獲得較高的重編碼效率，但技術相對復雜；重組蛋白技術涉及到蛋白重組及純化技術，對實驗室技術要求較高且實施成本較高，但其高度的安全性在日后的應用中仍然值得考慮[49,50]。

四、結論

研究表明，mESCs和hESCs均可以在體外分化成為單倍體雄性生殖細胞，但ESCs由于涉及到SCNT技術和胚胎等倫理問題，其臨床應用受到了極大的限制。相比之下，iPSCs源于自體細胞，逃開了胚胎來源的倫理問題，是目前唯一可以建立患者特異性疾病研究模型的資源。目前，已有研究表明，iPSCs不僅可以在體外分化成體細胞系，也可以分化成生殖細胞系。如果能利用無精子癥患者體細胞體外培養iPSCs，可以嘗試建立男性無精子癥疾病原因篩查的模型[51]；同時，利用患者iPSCs誘導其分化為有功能的雄性單倍體細胞，為不孕癥夫婦的IVF治療提供材料，將為男性不育患者的治療提供一個新的思路。

胚胎干細胞; 多能干細胞; 精子;細胞分化

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（2014-06-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.017

R 698.2