內質網應激與胰腺腺泡細胞損傷

鄭俊媛 曾悅

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中負責蛋白質合成、折疊修飾和質量監控的重要細胞器。任何擾亂ER穩態的因素如氧化應激、Ca2+紊亂、病毒感染等都可導致ER處于蛋白折疊的高負荷狀態，引發內質網應激(ERS)，激活多條下游信號通路，促進細胞生存；但如果應激反應過于強烈或持久時，ERS則引起細胞損傷甚至死亡[1]。胰腺腺泡細胞損傷被認為是胰腺疾病如胰腺炎和胰腺癌的起始發病環節，是目前胰腺疾病研究的中心環節之一。新近的研究報道，在細胞生物學水平上，ERS是引起腺泡細胞受損的最經典最主要的應激機制之一，ERS的過度激活很可能與胰腺組織的多種病理表現相關[2]。本文在綜合近年文獻報道的基礎上，針對ERS及下游信號通路與胰腺腺泡細胞損傷及相關疾病如胰腺炎、胰腺癌的關系作一簡要闡述。

一、內質網應激與未折疊蛋白反應

ERS激活的信號通路包括：(1)未折疊蛋白反應(UPR)：即由于錯誤折疊與未折疊蛋白質不能按正常途徑出ER從而在其腔內聚集所致，涉及ER與胞核、核糖體、高爾基體等多種細胞器間的信號傳遞。(2)內質網超負荷反應(ER-overload response，EOR)：由正確折疊的蛋白質在ER腔內過度蓄積引起的ER超負荷。EOR的效應是激活細胞核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)，與ERS時Ca2+庫釋放及活性氧產生有關。(3)固醇調節級聯反應：膽固醇缺乏引起的固醇調節元件結合蛋白通路調節的反應[3-4]。UPR是ERS最為關鍵的通路，也是研究較多和認識較深的一條通路。

UPR主要涉及ER膜上的3個感受器蛋白：PERK(PRK-like eukaryotic initiation factor 2α kinase)、IRE1(inositol requiring enzyme 1)和ATF6(activating transcription factor-6)。正常情況下，3種跨膜蛋白與分子伴侶GRP78/Bip(glucose-related protein of 78 kDa/ B-cell immunoglobulin-binding protein)結合，呈無活性狀態。ERS時未折疊或錯誤折疊蛋白在ER腔內大量堆積，招募GRP78/Bip使其與PERK、ATF6、IRE1解離，激活PERK-eIF2α、IRE1-XBP1和ATF6三大信號通路[5]。

PERK與GRP78/Bip解離后通過胞質內結構域自身二聚化和磷酸化而被激活，引起真核細胞起始因子eIF2α磷酸化失活，阻斷蛋白翻譯合成。同時，活化的PERK加強ATF4的轉錄翻譯，調節分子伴侶、氨基酸代謝、抗氧化應激和凋亡相關基因的表達。IRE1兼具絲/蘇氨酸蛋白激酶和核酸內切酶(RNase)活性，活化過程與PERK類似，活化后的IRE1剪切XBP1 mRNA分子內26bp的內含子，再翻譯產生一個新的41 000大小的含b-ZIP結構域有活性的轉錄因子sXBP1(spliced X-box binding protein 1)。sXBP1與基因啟動子區包括ERSE(ER stress enhancer)和UPRE(UPR element)在內的順式作用元件結合，誘導分子伴侶、折疊酶基因的表達，上調ER相關蛋白降解(ER associated degradation，ERAD)各組分，加快蛋白折疊和錯誤折疊蛋白的降解[6]；調節膜磷脂的合成，使ER膜擴張，ER體積增大[7]。ATF6與Bip分離后轉位到Golgi體，被S1P和S2P(Site 1 and Site 2 proteases)切割，釋放出N端轉錄激活結構域，產生活化型ATF6入核，作為轉錄因子誘導調節ERAD組分、XBP1等編碼基因轉錄。

UPR通過以上機制實現三方面的調節：(1)通過誘導ER內伴侶分子、折疊酶的增多以及ER體積的代償性增大等上調ER對蛋白的折疊能力；(2)在轉錄和翻譯水平減少蛋白的合成，減輕ER負荷；(3)通過上調ERAD清除過剩未折疊或錯誤折疊蛋白，最終恢復ER內環境穩態。

二、ERS誘導的細胞效應

輕度ERS時，ER通過激活UPR保護細胞免受損傷，促使細胞存活；激活的UPR也可啟動自噬，清除過剩的錯誤或未折疊蛋白，以恢復ER穩態[8]。而過度或持久的ERS超出細胞自身調節能力時，ER則啟動ER特有的凋亡途徑促使細胞凋亡，或過度激活自噬引起自噬性細胞死亡[9]。ERS還可通過UPR信號通路分子和EOR誘發細胞炎癥反應。

1．ERS與細胞凋亡：ERS可通過多條途徑誘導細胞凋亡，包括CHOP、Caspases的活化EY IRE1/TRAF2/JNK、ER-Mito信號通路的啟動等[10-11]。最具特征的是轉錄因子CHOP(C/EBP-homologous protein，也稱 GADD153)的激活，UPR三大信號通路均可激活CHOP，但主要通過PERK-eIF2α-ATF4軸。CHOP的效應包括：(1)上調GADD34表達，使p-eIF2α去磷酸化，恢復轉錄翻譯，大量新生蛋白進入ER加重其負擔。(2)下調抗凋亡蛋白Bcl-2、上調促凋亡蛋白Bim，誘導Bax/Bak介導的線粒體膜通透性增加，觸發線粒體凋亡途徑。(3)上調ERO1α(ER oxidase 1α)，通過氧化應激和胞質Ca2+超載誘導凋亡[12]。

2．ERS與細胞自噬：ERS介導的細胞自噬(autophagy)的發生主要依賴于UPR和Ca2+信號。研究顯示銜接ERS與自噬的信號通路包括PERK-eIF2α、IRE1-TRAF2-JNK、Ca2+-鈣調蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)-mTOR復合體1(mTORC1)通路等[9]。

3．ERS與細胞炎癥： 連接ERS與細胞炎癥的橋梁主要是NF-κB。NF-κB作為炎癥反應的核心轉錄因子，可激活一系列基因的表達，包括細胞因子(IL-1、IL-6)、黏附分子(E-選擇素、VCAM-1)、腫瘤壞死因子、補體、急性期反應蛋白以及酶類(NO合成酶、環氧合酶-2)等。ERS激活NF-κB的機制包括：(1)EOR：核心效應分子即NF-κB，與ERS時Ca2+貯存釋放以及活性氧產生有關[13]。(2)PERK： 鑒于IκB的半衰期遠遠短于NF-κB，PERK-eIF2α介導的翻譯阻斷可增加NF-κB/IκB的比例，導致NF-κB處于游離活化狀態。(3)IRE1：通過募集TNF-ɑ受體相關因子2(TRAF2)形成復合體，激活IκB激酶，活化NF-κB。(4)ATF6：可能通過Akt磷酸化介導下游通路中NF-κB的活化。

三、ERS與胰腺腺泡細胞損傷

胰腺腺泡細胞損傷是多種胰腺疾病的起始環節，包括急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)和胰腺癌。近年來，越來越多的研究發現ERS與胰腺腺泡細胞損傷相關疾病有密切的聯系。

1．ERS與急性胰腺炎：目前已有不少研究表明ERS與AP存在密切關聯。一方面，多種類型的AP動物模型(促分泌劑如CCK8和caerulein、L-精氨酸、高脂飲食、胰管內逆行注射牛黃膽酸鈉、胰管結扎等)均存在ERS的證據，包括ER形態結構(ER擴張、液化、腔內大量空泡)以及UPR標志分子(PERK、eIF2、ATF6、Xbp1、BiP、CHOP)表達水平的改變，且與AP嚴重程度相一致[14-16]。另一方面，通過基因測序技術發現，AP早期胰腺腺泡細胞即可出現一系列復雜的基因改變，其中很大一部分就是ERS關鍵分子調節基因，如UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UDPGT)、UDP-葡萄糖脫氫酶、DnaJ蛋白、血紅素氧合酶1、網鈣蛋白2等分子伴侶的編碼基因[17]。

大量攝入乙醇可增加患胰腺炎的風險，但很大一部分嗜酒人群通常并不發病。其機制可能為乙醇的攝入可增加胰腺腺泡細胞內質網的氧化應激，但可被強大的UPR這一適應性機制所代償，當UPR失代償時，則引起胰腺疾病[18]。Lugea等[19]考察了乙醇對Xbp1+/-小鼠胰腺炎的影響，結果發現，Xbp1+/-小鼠較野生鼠對乙醇誘導的ERS更為敏感，UPR通路顯著激活，出現AP的典型病理組織學改變，即胰腺腺泡細胞內消化酶原顆粒減少，大量的自噬體空泡，細胞死亡增加。據此推測UPR在乙醇導致胰腺腺泡損傷、誘導AP中發揮著重要的作用。

遺傳性胰腺炎(hereditary pancreatitis，HP)常由PRSS1基因編碼的胰蛋白酶過度活化或突變所致。胰蛋白酶原基因3號外顯子區346位堿基存在C→T雜合性突變，表達的氨基酸從精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，產生不對稱的半胱氨酸殘基，造成該蛋白不恰當的二硫鍵形成以及錯誤折疊。該錯誤折疊的蛋白在激活或降解方面無異于野生型胰蛋白酶原，但是分泌的量大大減少，大部分以不溶性形式滯留在胞內。這種錯誤折疊蛋白的大量表達伴隨著ERS標記分子水平的顯著增高，表明ERS(而非異常胰蛋白酶活性)可能是造成某些突變胰蛋白酶原誘導的HP的主要原因[2]。

在治療方面，應用牛磺熊去氧膽酸(一種化學性分子伴侶蛋白)或導入外源性Bip基因上調內質網Bip蛋白水平，可顯著下調ERS標記分子水平，減輕ER損傷，對AP有明顯的保護效應[20]。臨床常用于治療AP的傳統中藥——生大黃，除一貫認為的具有減輕炎癥反應、抑制胰酶激活、清除氧自由基及促進細胞凋亡的作用外，最近的一項研究發現其對AP的保護效應還與抑制ERS信號轉導分子IRE1α及其下游通路有關[21]。

對于ERS激活的下游通路信號分子NF-κB與AP的關系，已被學術界廣為認可，NF-κB在AP早期即被激活，與AP嚴重程度呈正相關[22]。

2．ERS與胰腺癌：癌組織的重要特點是癌細胞不受控制地快速生長，造成癌細胞處于一種低pH、低氧、低營養的微環境中，這些不利因素都可誘發ERS的UPR。越來越多的證據表明UPR在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用[23]。在多種癌癥動物模型中可見GPR94、鈣網蛋白(calreticulin)和鈣聯蛋白(calnexin)等分子伴侶表達上調，這些蛋白有助于腫瘤細胞抵御低氧、營養缺乏、未折疊蛋白堆積等不良刺激。ERS還可下調腫瘤抑制基因p53，上調促血管生成因子VEGF-A mRNA，促進腫瘤新生血管的形成。針對ERS靶點的抗腫瘤藥包括蛋白酶體抑制劑、BrefeldinA、Hsp90抑制劑、Bip/GRP78抑制劑或滅活劑等等，都已在實驗或臨床上取得一定程度的療效[24]。

雖然目前尚無研究直接比較胰腺癌細胞與正常胰腺組織中UPR組分如Bip等伴侶分子及p-eIF2α、ATF4、ATF6、sXBP1等的表達差異，但有報道在胰腺癌細胞中高度表達的孤兒核受體NR4A1，通過調節胰腺癌細胞ERS水平和自由基水平促進癌細胞的生存生長[25]。在治療方面，蛋白酶抑制劑如bortezamide可以通過激活ERS機制殺傷胰腺癌細胞[17]，Capsaicin誘導胰腺癌細胞凋亡的機制也涉及ERS[26]。

另一方面，ERS激活的NF-κB與多種腫瘤關系密切已被大量證據所證實。在多種惡性血液病以及包括胰腺癌在內的實體腫瘤中均可見NF-κB的持續活化，通過促進抗凋亡基因的表達從而抑制腫瘤細胞內的促凋亡信號轉導通路[27]。NF-κB與正常細胞的轉化、腫瘤干細胞的生存、腫瘤細胞的外侵新生血管及轉移、腫瘤細胞抗凋亡基因的調控等都密切相關。已有研究證實NF-κB可能通過影響p53、BRCA2、Rad51等基因表達水平及轉谷氨酰胺酶(transglutaminase，MTG)的生成等多種機制介導胰腺癌的發生、發展。阻斷NF-κB信號通路，再聯合傳統化療藥物，有望成為今后胰腺癌治療的極具潛力的方案[28]。

綜上所述，內質網應激活化的UPR三大信號通路和EOR激活的下游信號分子NF-κB與胰腺腺泡細胞損傷具有密切的關系。輕度ERS可以通過UPR重建ER穩態，恢復正常，是細胞對有害刺激的一種保護性手段；嚴重的ERS則引起腺泡細胞凋亡或者炎癥甚至壞死，是細胞的一種病理性反應，促進疾病的發生、發展。

隨著對胰腺腺泡細胞損傷與ERS相關性研究的不斷深入，新的機制不斷地被闡釋，基于ERS途徑的疾病治療策略也已取得了一些成果，但仍存在很多不明確之處，相信今后關于這方面的研究將為我們治療腺泡細胞損傷相關疾病提高新的視角和方法。

參 考 文 獻

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