糞便標(biāo)本中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在大腸癌早期篩查中的意義

張 虎，張 平，江 軍，李素迎，袁 林，齊 健，朱尤慶

(1武警湖北省總隊(duì)醫(yī)院，武漢430060;2武漢大學(xué)中南醫(yī)院;3湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心、湖北省腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

大腸癌(CRC)是胃腸道常見的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是降低CRC發(fā)病率、提高生存率的有效手段。目前常見的CRC篩查方式包括糞便潛血試驗(yàn)、電子結(jié)腸鏡、仿真結(jié)腸鏡檢查等，這些檢查存在敏感性和特異性低、需要嚴(yán)格的腸道準(zhǔn)備導(dǎo)致患者依從性差、對早期CRC的檢出率低等缺陷。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制是一種可遺傳的基因功能調(diào)控方式，DNA異常甲基化的改變是表觀遺傳修飾的主要方式之一。我們的前期研究顯示，SFRP家族基因啟動子甲基化在早期CRC組織中具有高頻甲基化。

本研究通過檢測CRC和大腸良性病變患者糞便標(biāo)本中SFRP1和WIF-1基因啟動子的甲基化狀況，探討二者作為CRC篩選標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年3月～2013年3月武漢大學(xué)中南醫(yī)院住院患者145例，其中CRC 48例，男24例、女24例，年齡19～86歲、平均61.1歲;大腸腺瘤35例，男23例、女12例，年齡25～74歲、平均56.3歲;大腸增生性息肉32例，男17例、女15例，年齡31～79歲、平均54.4歲。均經(jīng)術(shù)后病理或內(nèi)鏡活檢病理證實(shí)。入選標(biāo)準(zhǔn):無家族CRC及大腸息肉病史;收集糞便前5 d內(nèi)未進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查、灌腸等侵入性操作;CRC患者未行術(shù)前放化療。另選擇30例性別、年齡匹配的健康人作為對照組，全結(jié)腸鏡檢查均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集 收集受試者術(shù)前或腸鏡檢查前自然排出的新鮮糞便樣本，－80℃保存待測。

1.2.2 DNA提取 稱取 200 mg糞便，使用QIAamp糞便DNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)提取DNA。引物序列由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5'-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3'，下游引物:5'-AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度 133 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系:上下游引物各 1 μmol/L、模板 2 μL、PCR Mix 12 μL、雙蒸水 9 μL。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min，94℃、62℃、72℃各30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結(jié)果。

1.2.3 甲基化特異性PCR DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化回收主要根據(jù)文獻(xiàn)［1］方法，并加以改進(jìn)。修飾后DNA分別用各基因的甲基化、非甲基化引物擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程公司合成。SFRP1甲基化引物:上游引物:5'-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3'，下 游 引 物:5'-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度126 bp;SFRP1非甲基化引物:上游引物:5'-GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT-3'，下游引物:5'-CTCAACCTACAATCAAAAACAACACAAACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度135 bp。WIF-1甲基化引物:上游引物:5'-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3'，下游引物:5'-AAACCAACAATCAACGAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度197 bp;WIF-1非甲基化引物:上游引物:5'-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3'，下游引物:5'-AAACCAACAATCAACAAAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度198 bp。PCR反應(yīng)體系 25 μL:模板 DNA 2 μL、5 μmol/L 上下游引物各 1 μL、Mg2+1.5 mmol/L、10 mmol/L、dNTPs 2 μL、Taq酶1 U。PCR反應(yīng)條件:95℃ 5 min，95℃、各基因的退火溫度、72℃各45 s，38個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。反應(yīng)產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)照相并分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組糞便中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化狀態(tài) 見表1。SFRP1和WIF-1聯(lián)合檢測CRC和大腸腺瘤的敏感性分別為77.1%和65.7%，特異性為93.3%。SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在CRC組和腺瘤組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而在CRC組和增生性息肉組、CRC組和對照組、腺瘤組和增生性息肉組、腺瘤組和對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＜0.05)。增生性息肉組和對照組SFRP1基因甲基化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，WIF-1基因甲基化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組SFRP1和WIF-1基因甲基化陽性率［例(%)］

2.2 聯(lián)合檢測SFRP1和WIF-1基因甲基化對大腸腺瘤的診斷 腺瘤組糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化陽性率分別為57.1%和42.9%，進(jìn)展期腺瘤明顯高于非進(jìn)展期腺瘤。SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在進(jìn)展期腺瘤和增生性息肉間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);而非進(jìn)展期腺瘤和增生性息肉間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。聯(lián)合兩種基因?qū)RC和進(jìn)展期腺瘤的檢測率分別為77.1%和80.0%。

2.3 CRC糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系 CRC糞便DNA中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤部位、Duke分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P均＞0.05)。見表2。

表2 糞便SFRP1和WIF1基因甲基化與CRC臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

CRC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多步驟漸進(jìn)演化的過程，涉及遺傳性改變和表觀遺傳的異常［2］。腫瘤抑制基因的表觀沉默是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。正常情況下，大腸上皮細(xì)胞會持續(xù)釋放到腸腔內(nèi)，并隨糞便排出體外，整個(gè)腸黏膜4 d內(nèi)更新1次［3］。大腸惡性瘤細(xì)胞脫落速度是正常細(xì)胞的4～5倍［4］，由于腫瘤細(xì)胞更新速度快，黏附力差，很容易在糞便中檢測到與CRC相關(guān)的分子標(biāo)志物。因此糞便異常基因甲基化在大腸腫瘤早期篩查診斷中具有重要的臨床價(jià)值。

Wnt途徑在細(xì)胞的增殖和分化等生理過程中起重要作用，同時(shí)參與腫瘤形成的異常調(diào)控途徑。Wnt途徑異常激活促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡［5］，與多種人類腫瘤相關(guān)，如頭頸部腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、白血病等，大腸腫瘤尤其常見［6～10］。SFRP 家族、WIF-1是Wnt途徑Ⅰ類胞外拮抗物，能通過不同的機(jī)制直接與Wnt反應(yīng)，或與Frizzled受體形成無作用的復(fù)合體，抑制 Wnt途徑［11］。正常情況下，Wnt拮抗基因的表達(dá)能有效地抑制Wnt途徑的激活。

本研究顯示，增生性息肉、腺瘤和CRC患者，糞便SFRP1基因啟動子甲基化的陽性率分別為21.9%、57.1%和 68.8%，而 WIF-1 基因甲基化的陽性率分別為18.8%、42.9%和60.4%。SFRP1和WIF-1基因甲基化在增生性息肉、腺瘤和CRC的發(fā)生頻率逐漸增高，提示它們可能是正常大腸黏膜發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。我們前期的研究也顯示，SFRP家族、WIF-1基因在大腸腫瘤早期存在高頻率甲基化［9］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅6%的腺瘤會轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔１狙芯匡@示，糞便中SFRP1和WIF-1基因甲基化對于進(jìn)展期腺瘤的檢測率明顯高于非進(jìn)展期腺瘤，進(jìn)展期腺瘤中聯(lián)合SFRP1和WIF-1基因的甲基化頻率為80.0%，明顯高于非進(jìn)展期腺瘤的55.0%，說明進(jìn)展期腺瘤組織有惡變趨勢。表明SFRP1和WIF-1基因甲基化是CRC的一個(gè)頻繁的早期事件，且在CRC演變過程中通過腺瘤致癌的轉(zhuǎn)化而增加，二者聯(lián)合對進(jìn)展期腺瘤的檢測率達(dá)73.3%。經(jīng)典的腺瘤—腺癌途徑大概需要5～10年的時(shí)間，因此在CRC的早期篩查中有充分的時(shí)間可以檢測并去除這些高危病變，對可疑病例行結(jié)腸鏡檢查并治療，從而降低CRC的發(fā)生率。

本研究中，對照組SFRP1和WIF-1基因異常甲基化各出現(xiàn)1例，此結(jié)果可能是由于SFRP1和WIF-1異常甲基化頻繁出現(xiàn)在癌前隱窩病灶，且病變較小，而內(nèi)鏡下未能發(fā)現(xiàn)。因此，糞便中 SFRP1和WIF-1基因異常甲基化的患者屬于CRC的危險(xiǎn)人群，需要長期跟蹤隨訪。本研究尚未發(fā)現(xiàn)糞便中基因甲基化狀態(tài)的改變與大腸腫瘤的臨床病理特征有相關(guān)性，表明這些標(biāo)記物在近端、遠(yuǎn)端大腸腫瘤的檢測中具有同等的檢測效率。近年來，右半結(jié)腸腫瘤的發(fā)生率逐年增加［12］，糞便SFRP1和WIF-1甲基化在早期篩查右半結(jié)腸癌方面具有重要作用。

綜上所述，糞便SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化有可能成為大腸腫瘤早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志，有望成為CRC早期無創(chuàng)診斷或高風(fēng)險(xiǎn)人群篩選的一種新型途徑。

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