魚腥草素鈉聯合氨芐西林對表皮葡萄球菌的抗菌作用

賈 芳，楊江流，劉文慧，邢立群

(河套學院醫學系，內蒙古巴彥淖爾015000)

表皮葡萄球菌(SE)是臨床常見的條件致病菌，常伴隨生物材料的置入如插管、人工瓣膜、透析等醫療技術和一次性材料進入人體內，并通過黏附在生物材料表面形成細菌生物膜而使細菌產生耐藥性，給臨床治療帶來困難［1］。中藥魚腥草的主要抗菌成分為癸酰乙醛，向癸酰乙醛中加入亞硫酸氫鈉制成的魚腥草素鈉，性質穩定又保留了抗菌活性［2］。管研等［3］報道，500 mg/L 的魚腥草素鈉對SE生物被膜的形態有顯著影響，聯合紅霉素在亞濃度下就能有效抑制SE生物被膜的黏附和代謝。氨芐西林(AM)為廣譜半合成青霉素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、耐酸、低毒等特點，但其對β-內酰胺酶不穩定，細菌易產生耐藥性。由于耐藥菌的出現，單一抗菌藥物已經失去療效，因此聯合用藥成為控制和減少耐藥菌株產生的有效手段［4］。2014年1～3月，我們觀察了魚腥草素鈉聯合AM對SE的體外抑制作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 8株臨床分離SE菌株(巴彥淖爾市第二醫院饋贈)，ATCC 29213質控菌株購買于美國菌株保藏所。魚腥草素鈉購于中國標準藥品中心，溶于無菌水中配制成0.1 mol/L的藥液，AM溶于磷酸緩沖液中配制成0.1 mol/L的藥液，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 接種菌懸液的制備 將實驗菌株劃線接種于固體MH培養基過夜培養，挑去單菌落按1∶100接種于液體MH培養基中，37℃搖床過夜培養，稀釋至0.5麥氏管濁度，再將該菌懸液用MH液體培養基1∶20稀釋后使用。

1.2.2 藥物單獨抗菌活性測定 采用二倍稀釋法［5］測定。在96孔細胞培養板外圍孔中加200 μL蒸餾水，剩余孔均加入100 μL MH液體培養基及100 μL接種菌懸液(包括無藥對照孔)。將100 μL工作濃度藥液加入每排第一個孔，然后依次進行二倍稀釋。同時設置10∶100和1∶100菌懸液的稀釋對照，表示10%和1%細菌污染檢測。魚腥草素鈉檢測濃度范圍為 0.78 ～100 μg/mL，AM 為 0.5 ～1 024 μg/mL。平板置于密封袋中，5%CO2、37 ℃孵育過夜。當質控菌株的MIC值處于質控范圍時，以肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細菌生長者，即為受試菌的MIC。MIC值測定重復3次。

1.2.3 藥物聯合抗菌活性測定 采用微量棋盤法［5］測定。將魚腥草素鈉與AM的MIC值兩兩組合，每孔抗菌藥物各50 μL加入到96孔板中，試驗孔及無藥對照孔均加入100 μL MH液體培養基及100 μL菌懸液。聯合用藥各藥物檢測最終濃度范圍同單藥檢測相同，MIC值判定方法相同。藥物效果判定參照文獻［6］方法，部分抑菌濃度指數(FICI)=(MICa聯合/MICa單獨)+(MICb聯合/MICb單獨)，FICI≤0.5 表示兩者協同，0.5 ＜ FICI≤4 表示兩者不相關，FICI＞4表示兩者拮抗。

1.2.4 藥物殺菌效力評估 從上述實驗中隨機抽取1株耐藥菌，分別接種于含有魚腥草素鈉單藥、AM單藥、魚腥草素鈉聯合AM的液體培養基中培養(其濃度為魚腥草素鈉和AM的MIC)，另設不加藥物的空白對照孔，37℃孵育過夜，于0、12、24、36 h每孔取100 μL，用比濁管對比稀釋至1×106個細菌/管，取100 μL接種于MH固體培養基，37℃孵育過夜，記錄平板上的菌落數，換算成log10的形式，實驗重復3次。判斷標準參照文獻［6］，聯合用藥與單獨用藥相比，菌落數減少≥2log10cfu/mL為協同，減少或增加＜2log10cfu/mL為不相關，增加≥2log10cfu/mL為拮抗。

1.2.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，結果以±s表示，數據的比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗SE活性測定結果 見表1。AM單獨對SE的MIC為2～64 μg/mL，魚腥草素鈉單獨對 SE的MIC 為12.5 ～50 μg/mL;二者聯合后，AM 對 SE 的MIC降至0.5～16 μg/mL，魚腥草素鈉對 SE 的 MIC降至0.78 ～6.25 μg/mL，AM 的 MIC 下降了 4 倍，魚腥草素鈉的MIC下降了8～16倍，FICI是0.250～0.375，表明二者具有協同作用。

表1 魚腥草素鈉、AM單獨和聯合抗SE的MIC和FICI

2.2 殺菌效力評估結果 篩選22號和6號菌株進一步試驗，如圖1、2所示，不加藥物的對照孔0～36 h細菌繼續生長，魚腥草素鈉、AM單獨作用也沒有抑制細菌生長，但相同濃度下魚腥草素鈉聯合AM抑制了細菌生長，藥物單獨作用與聯合作用比較有統計學差異(P＜0.01)。聯合用藥與單獨用藥相比，菌落數的減少量明顯＞2log10 cfu/mL，因此魚腥草素鈉聯合AM對SE的作用具有協同效果。

圖1 魚腥草素鈉 3.125 μg/mL、AM 0.5 μg/mL單獨及聯合作用于6號SE

圖2 魚腥草素鈉 6.25 μg/mL、AM 16 μg/mL單獨及聯合作用于22號SE

3 討論

中草藥具有殺菌抗菌作用，且不易產生耐藥性。AM為青霉素類抗生素，根據美國臨床與實驗室標準化研究所(CLSI)判斷標準，AM單獨作用8株SE的MIC為2～64 μg/mL，均為耐藥菌株，AM單獨作用 ATCC29213標準菌株的 MIC值為0.5 μg/mL，在質控范圍內。由于抗生素的濫用導致耐藥菌株的增加，尋找能抑制耐藥菌株的抗生素成為近年研究的熱點。Beecham制藥公司首先報道了BRL42715的合成及生物活性，其對革蘭陽性菌的抑菌活性較強，而對革蘭陰性菌的抗菌活性弱，是目前最好的廣譜內酰胺酶抑制劑，與已知的β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦相比，具有更強的抑酶活性及更廣的抗菌譜［7］。Synphar和Taibo公司研制合成的SYN-2190屬單環β-內酰胺化合物，可特異性鈍化腸桿菌、檸檬桿菌、假單孢菌和摩氏摩根菌屬染色體介導的耐藥菌，是C型β-內酰胺酶的有效競爭性抑制劑［8］。SE耐青霉素類抗生素的機制主要包括生物被膜和青霉素酶產生及其BPB的改變［9］。本實驗選擇了8株多重耐藥SE分離株，觀察魚腥草素鈉聯合青霉素類抗生素的抗菌作用，結果顯示魚腥草素鈉聯合青霉素類抗生素對SE的抗菌作用明顯優于單獨作用。下一步我們將利用分子生物學手段探討魚腥草素鈉是否具有抑制青霉素酶的作用，故本實驗選取了AM而非耐青霉素酶的甲氧西林等抗生素類藥物。

近年來，中藥抑制耐藥性菌株取得了較大成就。魚腥草性味辛、寒，具有清熱解毒、清腫排膿、利尿通淋之功效，臨床用于治療腫癰化膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒等?，F代藥理研究表明，魚腥草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、利尿作用，還可增強機體免疫功能、平喘鎮咳［10］，對卡他球菌、金黃色葡萄球菌、流感桿菌、肺炎球菌具有明顯的抑制作用［11］。本研究顯示，魚腥草素鈉單獨作用8株SE 的 MIC 為12.5 ～50.0 μg/mL，與 AM 聯合后，其對SE的MIC均下降，與朱玲玲等［12］的報道一致。與管研等［13］報道的魚腥草素鈉對強產膜SEATCC35984的 MIC 值0.0625 μg/mL 不一致，可能與本實驗臨床分離株耐藥性更強有關。

本研究對AM和魚腥草素鈉進行殺菌效力評估，結果顯示，相對于起始細菌數1×106/管，不加藥對照組、單獨AM和魚腥草素鈉細菌生長曲線向右呈上升趨勢，而魚腥草素鈉與AM聯合用藥后細菌生長曲線向右呈下升趨勢，說明聯合用藥與單獨用藥相比對細菌的殺菌效力增加?？傊?，魚腥草素鈉與AM具有協同抗菌作用，其作用機制可能是由于藥物抑制了酶的作用，也可能是作用于其他蛋白質。

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