健脾解毒方逆轉(zhuǎn)大腸癌細(xì)胞多藥耐藥的作用機制

李先茜，吳嘉熙，范忠澤，孫燕妮，高 虹

(1上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院)

多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥 物產(chǎn)生耐藥性后，對從未使用過的、結(jié)構(gòu)和機制不同的多種化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性［1］，是導(dǎo)致化療效果差的主要原因［2］。MDR與MDR基因MDR-1的過度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)MDR-1編碼產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)增多有關(guān)［3］，因此通過藥物影響MDR-1的表達(dá)來消除腫瘤細(xì)胞對化療的耐藥性，可增加化療效果［4］。研究發(fā)現(xiàn)，對晚期大腸癌患者加用健脾解毒方后，其化療效果明顯增強。2004年1月～2013年12月，我們觀察了健脾解毒方對大腸癌MDR基因表達(dá)的影響，檢測用藥前后腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號因子Akt磷酸化的改變，探討健脾解毒方逆轉(zhuǎn)大腸癌MDR基因的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 體質(zhì)量約250 g的SD大鼠20只，大腸癌細(xì)胞敏感株(HCT-8)及耐藥株(HCT-8/V)購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，PI3K抑制劑LY294002 購自Cell Signaling Technology，Inc(Danvers，MA，USA)，健脾解毒方(由生黃芪、黨參等11味中藥組成)購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中藥房，長春新堿(VCR)購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，抗p-Akt抗體購自SANTA公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清配制［3］與細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠隨機分為藥物組和對照組各10只，分別給予健脾解毒方劑和生理鹽水連續(xù)灌胃5 d，腹主動脈取血，分離血清。藥物組血清應(yīng)用對照組血清分別配制成0%(空白血清)、5%、10%、15%、20% 的藥物血清，－20℃保存?zhèn)溆谩CT-8和HCT-8/V細(xì)胞加入含10%小牛血清的RPMI1640高糖培養(yǎng)基，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁并覆蓋培養(yǎng)皿底80%后，用0.25%胰酶消化，每3～4 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞生長抑制實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入100 μL含5%、10%、15%、20%健脾解毒方的藥物血清，以及空白血清+10 mol/L LY294002組，20%藥物血清+10 mol/L LY294002組，對照組為不含藥物的等體積空白血清。分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組每個時間點設(shè)5個復(fù)孔。實驗組于相應(yīng)時間點分別加入100 μL長春新堿(終濃度20 g/mL)，對照組加入等量生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察，并進(jìn)行MTT比色實驗，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度A值，以空白組平均值調(diào)零，計算細(xì)胞生長抑制率:抑制率(%)=［(1－實驗孔平均A值)/對照孔平均A值］×100%。

1.2.3 實時熒光定量 PCR法檢測 MDR-1 mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為空白血清組、20%藥物血清組、空白血清+10 mol/L LY294002組、20%藥物血清+10 mol/L LY294002組培養(yǎng)48 h。按Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。MDR-1 mRNA上游引物:AAAAAGATCAACTCGTACCACTC，下游引物:GCACAAAATACACCAACAA;βactin上游引物:CTACGTCGCCCTGGACTTCGAGC，下游引物GATGGAGCCGCCGATCCACACGG。反應(yīng)體系:100 ng/μL cDNA 1 μL，PCR 混合物 10 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，DNA polymerase 0.2 μL，DEPC-H2O 6.8 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 10 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，記錄相關(guān)Ct值。使用未處理的HCT-8/V細(xì)胞的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組MRD-1 mRNA的相對模板數(shù)，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 Western blot方法測定 P-gp 及磷酸化 Akt蛋白(p-Akt)［6］取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為空白血清組、20%藥物血清組、空白血清+10 mol/L LY294002組、20%藥物血清+10 mol/L LY294002組，培養(yǎng)48 h。PBS沖洗，加入細(xì)胞裂解液，離心取上清，蛋白定量后分別取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，依次加入一抗、二抗，室溫孵育2 h。TBST緩沖液洗滌，加入化學(xué)發(fā)光試劑，壓片，顯影，定影，照相。使用抗MDR-1兔多克隆抗體檢測MDR-1蛋白，抗p-Akt鼠單克隆抗體檢測p-Akt。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 PEMS3.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示。多樣本比較以單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞生長抑制率比較 見表1。長春新堿對HCT-8/V的生長抑制作用與健脾解毒方的藥物血清濃度及作用時間呈正相關(guān)。使用LY294002預(yù)處理HCT-8/V后，長春新堿的細(xì)胞生長抑制率增高了4～6倍;聯(lián)合使用20%藥物血清和LY294002后，長春新堿的生長抑制率增高了5～8倍(P均＜0.01)。

2.2 MDR-1 mRNA在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 見表2。MDR-1 mRNA在HCT-8/V中的相對表達(dá)量較HCT-8明顯增高(P＜0.01)。使用20%的藥物血清預(yù)處理 HCT-8/V 細(xì)胞24、48、72 h，MDR-1 mRNA 在HCT-8/V中的相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。在相同的作用時間里，HCT-8/V中MDR-1 mRNA表達(dá)水平與藥物血清濃度呈線性反比關(guān)系，使用同一藥物血清濃度預(yù)處理細(xì)胞，MDR-1 mRNA表達(dá)量和作用時間呈線性反比關(guān)系。使用LY294002預(yù)處理細(xì)胞24、48、72 h，HCT-8/V 中 MDR-1 mRNA 表達(dá)較空白血清明顯降低(P均＜0.01)。

表1 藥物血清與LY294002對細(xì)胞生長抑制率的影響(n=5，%，±s)

表1 藥物血清與LY294002對細(xì)胞生長抑制率的影響(n=5，%，±s)

注:與同組空白血清比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 HCT-8空白血清比較，#P ＜0.01

組別 細(xì)胞生長抑制率24 h 48 h 72 h HCT-8細(xì)胞空白血清 60.0 ±2.4 65.0 ±2.5 63.0 ±3.1 20%藥物血清 57.0 ±2.1 59.0 ±3.2 67.2 ±2.7 HCT-8/V細(xì)胞空白血清 3.2 ±0.4# 3.7 ±0.3# 3.7 ±0.5#5%藥物血清 3.8 ±0.2 5.7 ±0.3* 8.0 ±0.7＊＊10%藥物血清 4.1 ±0.4* 8.2 ±0.4＊＊11.0 ±0.5＊＊15%藥物血清 4.8 ±0.5* 9.8 ±0.3＊＊12.3 ±0.6＊＊20%藥物血清 5.9 ±0.4＊＊11.0 ±1.1＊＊15.0 ±0.8＊＊空白血清 +LY294002 13.0 ±1.1*19.0 ±0.3*25.0 ±1.2*20%藥物血清 +LY294002 16.0 ±0.6*23.0 ±0.7*31.0 ±1.1*

表2 藥物血清與LY294002對大腸癌細(xì)胞MDR-1 mRNA 表達(dá)的影響(n=3，±s)

表2 藥物血清與LY294002對大腸癌細(xì)胞MDR-1 mRNA 表達(dá)的影響(n=3，±s)

注:與同組空白血清比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 HCT-8空白血清比較，#P ＜0.01

組別MDR-1 mRNA 表達(dá)24 h 48 h 72 h HCT-8細(xì)胞空白血清 10.2 ±2.4 15.1 ±1.5 13.0 ±2.2 20%藥物血清 11.0 ±1.1 12.0 ±3.0 14.0 ±2.3 HCT-8/V細(xì)胞空白血清 75.2 ±2.4# 78.1 ±1.5# 77.0 ±2.2#5%藥物血清 57.1 ±1.3* 51.7 ±1.3* 48.0 ±2.7*10%藥物血清 54.1 ±3.4* 46.1 ±1.4* 41.0 ±1.5＊＊15%藥物血清 44.8 ±2.5* 39.8 ±2.3＊＊ 32.3 ±1.6＊＊20%藥物血清 35.9 ±2.2＊＊ 31.0 ±1.2＊＊ 25.0 ±1.2＊＊空白血清+LY294002 23.0 ±3.1＊＊ 19.0 ±3.1＊＊ 15.0 ±1.1＊＊20%藥物血清 +LY294002 16.0 ±2.2＊＊ 13.0 ±1.8＊＊ 11.0 ±1.2＊＊

2.3 健脾解毒方對大腸癌細(xì)胞P-pg蛋白表達(dá)及p-Akt的影響 P-pg在HCT-8/V中的相對表達(dá)量明顯高于 HCT-8。應(yīng)用健脾解毒方藥物血清和LY294002預(yù)處理HCT-8/V細(xì)胞48 h，P-pg表達(dá)均下降，二者聯(lián)合預(yù)處理HCT-8/V細(xì)胞48 h，MDR-1 mRNA和 P-pg蛋白均明顯下降(P均 ＜0.05)。20%藥物血清處理HCT-8/V細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)水平無明顯改變，使用LY294002處理細(xì)胞后，p-Akt明顯下降，藥物血清與LY294002聯(lián)合處理HCT-8/V，兩者在降低p-Akt上呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。見表3。

表3 藥物血清及LY294002對人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞中P-gp 蛋白表達(dá)及 p-Akt的影響(n=3，±s)

表3 藥物血清及LY294002對人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞中P-gp 蛋白表達(dá)及 p-Akt的影響(n=3，±s)

注:與同組空白血清比較，*P＜0.05;與 HCT-8空白血清比較，△P ＜0.05

組別P-gp p-Akt HCT-8細(xì)胞空白血清 22.1 ±2.0 9.3 ±1.4 20%藥物血清 25.1 ±1.5 8.9 ±0.8 HCT-8/V細(xì)胞空白血清 64.1 ±2.2△ 77.0 ±2.1△20%藥物血清 34.2 ±1.8* 18.0 ±0.9*空白血清 +LY294002 29.0 ±1.0* 14.0 ±1.1*20%藥物血清 +LY294002 12.7 ±0.8* 10.0 ±0.7*

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大腸癌是由毒邪損傷腸絡(luò)、痰瘀凝聚腸道及正氣不足所致，其病機以脾胃虛弱為本，瘀毒內(nèi)結(jié)為標(biāo)，治則為健脾化瘀解毒。健脾解毒方具有健脾解毒活血之功效，用于治療大腸癌已取得一定效果。

MDR是常見的化療耐藥現(xiàn)象，這種耐藥性多針對各種天然來源的親脂性藥物，包括長春新堿、蒽環(huán)類、表鬼臼毒素類、放線菌素D、絲裂霉素、秋水仙堿以及紫杉醇等［7］。化療藥物與細(xì)胞膜上的P-gp結(jié)合后，ATP結(jié)合區(qū)被活化水解釋放能量，藥物尚未發(fā)揮抗腫瘤作用時，水解釋放能量將抗腫瘤藥物從細(xì)胞膜內(nèi)向膜外的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞膜內(nèi)藥物濃度降低，達(dá)不到抗腫瘤效果，產(chǎn)生耐藥性。目前，臨床一般通過藥物影響MDR-1的表達(dá)來消除腫瘤細(xì)胞對化療的耐藥性，增加腫瘤化療的有效性。研究顯示，健脾解毒方可降低腸癌患者外周血MDR1 mRNA和CK20 mRNA，調(diào)節(jié)P-gp［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾解毒方能有效提高大腸癌耐藥細(xì)胞株對長春新堿的藥物敏感性，而且藥物敏感性的提高與藥物作用時間及藥物劑量呈正相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)健脾解毒方與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合用藥對提高耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性具有協(xié)同效應(yīng)。

有關(guān)MDR的發(fā)生機制中，研究最多的是P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥。P-gp是由MDR-1基因編碼的跨膜糖蛋白，分子量為170 kD，由1 280個氨基酸組成［8］。P-gp能與抗癌藥物結(jié)合，將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，隨著抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度的不斷下降，藥物的細(xì)胞毒作用逐漸減弱甚至消失，從而無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞而引起 MDR［9］。

目前逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤耐藥性的藥物逆轉(zhuǎn)劑主要有針對P-gp的逆轉(zhuǎn)劑，共包括3代。第1代P-gp抑制劑包括鈣離子拮抗劑、鈣通道阻滯劑、免疫抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、抗生素和表面活性劑等。第2代P-gp抑制劑主要有4種:右維拉帕米、右尼古地平、PSC833和 VX710。第 3代 P-gp抑制劑包括XR9576、Tariquidar、R101933 等［10］;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)劑，如丁硫氨酸亞砜胺、硝基咪唑類［3］;針對MRP的逆轉(zhuǎn)劑;針對肺耐藥蛋白的逆轉(zhuǎn)劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)有關(guān)的逆轉(zhuǎn)劑;核酶逆轉(zhuǎn)MDR、MDR反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)、RNA干擾、腫瘤基因工程疫苗等基因治療。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)重要的下游直接效應(yīng)分子，具有調(diào)控細(xì)胞的大小、生長、增殖、存活以及糖代謝等重要作用。Akt可在PI3K作用下磷酸化，形成p-Akt。p-Akt可通過cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)從而抑制細(xì)胞調(diào)亡;還有研究提示，p-Akt能直接抑制caspase-9的活性，從而阻斷其介導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡。另外，p-Akt還能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子家族NF-κB和P53的作用影響細(xì)胞存活。

Akt是PI3K下游作用的靶蛋白，是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心，可被很多生長因子激活，進(jìn)而通過抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖在腫瘤的發(fā)生以及耐藥中起重要作用。Akt在P13K或缺氧微環(huán)境的刺激下發(fā)生磷酸化，激活的Akt從細(xì)胞質(zhì)募集至胞膜或轉(zhuǎn)位到胞核，使底物蛋白特定部位的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化。p-Akt通過抑制凋亡促進(jìn)細(xì)胞的存活，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。

目前國內(nèi)關(guān)于中藥逆轉(zhuǎn)MDR的體外實驗已取得一定進(jìn)展。本研究觀察了健脾解毒方逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥基因中PI3K/Akt信號通路的動態(tài)變化，并觀察阻斷PI3K/Akt信號通路對健脾解毒方逆轉(zhuǎn)大腸癌MDR基因的影響，從PI3K/Akt信號角度探討該方逆轉(zhuǎn)MDR的機制。結(jié)果顯示，健脾解毒方對大腸癌MDR有逆轉(zhuǎn)作用，在逆轉(zhuǎn)大腸癌MDR基因的調(diào)控中，可以逆轉(zhuǎn)大腸癌MDR-1的同時，伴隨著p-Akt的變化。推測健脾解毒方逆轉(zhuǎn)大腸癌MDR基因過程中，可能通過 PI3K/Akt信號通路調(diào)控MDR基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR，為中醫(yī)健脾解毒治法治療大腸癌提供了實驗依據(jù)。

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