盆腔腫瘤放療對(duì)兔直腸組織放射性纖維化形成的作用及機(jī)制

陳海燕，楊 旭，王沛靚

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊830011)

纖維化是機(jī)體組織受外界因素刺激后的一種修復(fù)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積［1］。放射性纖維化是惡性腫瘤患者臨床放射治療后常見并發(fā)癥［2］。放療是盆腔腫瘤主要的治療手段，大劑量放射治療可導(dǎo)致盆腔纖維化，包括直腸纖維化、輸尿管纖維化，嚴(yán)重者會(huì)誘發(fā)淋巴管阻塞和輸尿管梗阻［3］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子在纖維化的形成過程中扮演重要角色，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)是盆腔放射性纖維化的關(guān)鍵因子［4］。2013年3～7月，我們對(duì)新西蘭大白兔給予放射線照射，探討放射性纖維化的形成機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雌性新西蘭大白兔20只，體質(zhì)量(2 000 ±200)g。TGF-β(mRNA)ISH DIG Kit購(gòu)自天津顥洋生物制品科技有限責(zé)任公司;鼠抗兔Ⅲ型膠原單克隆抗體IgG購(gòu)自美國(guó)Merck公司;NF-κB多克隆抗體、TGF-β多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司;SP免疫組化試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 將兔隨機(jī)分成空白對(duì)照組、照射4周組、照射12周組和照射16周組，采用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢，首先確定X射線模擬機(jī)照射范圍，照射視野為恥骨聯(lián)合至恥骨聯(lián)合上緣4 cm，腹白線左右2 cm，視野范圍4 cm×4 cm。消毒腹部皮膚后，沿腹正中線切開，進(jìn)入腹腔，給予6 MeV β射線單次大劑量照射，照射距離為100 cm，劑量為20 Gy，劑量率為400 cGy/min。照射結(jié)束后關(guān)腹，縫合。空白對(duì)照組操作過程同放射組，但不進(jìn)行射線照射。術(shù)后室溫、常規(guī)飼養(yǎng)，自術(shù)后第2天開始皮下注射雌二醇0.05 mg/d，持續(xù)4 d。于照射4周、12周和16周末分別處死對(duì)應(yīng)組動(dòng)物，空白對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)完成時(shí)統(tǒng)一處死。

1.2.2 病理學(xué)檢查 取兔的直腸和輸尿管，10%甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切5～8 μm厚的切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精染色，伊紅復(fù)染。再經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色情況。

另取石蠟切片行Azan染色，切片常規(guī)入水、水洗，放入37℃偶氮卡紅液中放置4 h，冷卻后蒸餾水清洗，用含1%苯胺的95%乙醇溶液分色，0.5%磷鎢酸水溶液放置3～5 min，再放入苯胺藍(lán)—橘黃G染液30 min，擦干后95%乙醇分色，乙醇梯度洗脫，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下評(píng)價(jià)放射性直腸纖維化的程度。

1.2.3 TGF-β、NF-κB 表達(dá)檢測(cè) 提取各組盆腔組織蛋白，采用蛋白印跡法檢測(cè)TGF-β、NF-κB表達(dá)，采用雙縮脲法測(cè)定直腸組織蛋白含量，制樣(含50 μg蛋白)，金屬浴5 min，冷卻后上樣。制備8% ～10%的 SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳2～4 h，轉(zhuǎn)移PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用 TGF-β和NF-κB一抗孵育，4℃過夜，清洗，二抗室溫孵育1 h，清洗，ECL顯色，暗室洗片，行定量分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)多個(gè)均數(shù)間差異性，當(dāng)組間存在顯著性差異時(shí)用t檢驗(yàn)，進(jìn)行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組直腸組織細(xì)胞排列整理，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn);照射4周組可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血水腫;照射12周組可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血、水腫明顯，細(xì)胞腫脹、壞死、脫落，黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)締組織呈纖維化改變;照射16周組可見巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和典型的外結(jié)締組織纖維化改變。見圖1。

圖1 各組直腸組織HE染色結(jié)果

Azan染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組直腸組織中未見纖維化表達(dá)，照射4周組直腸組織中見少量藍(lán)色纖維化表達(dá)，照射12、16周組直腸組織中見大量纖維化表達(dá)。見圖2。

圖2 各組直腸組織Azan染色結(jié)果

2.2 直腸組織細(xì)胞因子變化 各組直腸組織中的TGF-β和 NF-κB蛋白表達(dá)見圖 3。直腸組織中TGF-β蛋白及核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)均隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。見圖3。

3 討論

圖3 直腸組織細(xì)胞因子變化

放射性纖維化是惡性腫瘤患者臨床放射治療后常見并發(fā)癥。本研究采用射線大劑量照射新西蘭大白兔后，檢測(cè)直腸組織病理學(xué)改變，空白對(duì)照組直腸組織中細(xì)胞排列整理，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，照射4～16周后可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血水腫明顯，細(xì)胞腫脹壞死，脫落，黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)締組織呈纖維化改變。Azan染色空白對(duì)照組直腸組織中未見纖維化表達(dá)，照射第4～16周后見藍(lán)色纖維化表達(dá)，可見直腸組織中大量纖維化形成。

纖維化是機(jī)體組織受外界因素刺激后的一種修復(fù)過程，放射治療中常出現(xiàn)放射性纖維化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積以及成纖維細(xì)胞的過度繁殖。研究表明，纖維化的形成與發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，存在不斷重建和成纖維細(xì)胞被長(zhǎng)期激活等特點(diǎn)［5］。在慢性纖維化形成及發(fā)展的過程中，成纖維細(xì)胞的激活是關(guān)鍵。在纖維化形成期，始終伴隨著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、大量巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞聚集在新生毛細(xì)血管，同時(shí)并存著大量成纖維細(xì)胞，而這些成纖維細(xì)胞被激活后多成為細(xì)胞骨架蛋白，進(jìn)而參與傷口的收縮。研究表明，TGF-β是盆腔放射性纖維化的關(guān)鍵因子，其表達(dá)程度與纖維化進(jìn)程呈正相關(guān)［6～9］。TGF-β 具有多種生物學(xué)特性，主要包括:誘發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)快速反應(yīng)，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或改變細(xì)胞增殖情況等［10～12］;對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等;通過影響對(duì)細(xì)胞周期變化起調(diào)控作用的蛋白激酶的活性，抑制細(xì)胞增殖。TGF-β具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，因此通過影響TGF-β信號(hào)通路可能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究顯示，直腸組織中TGF-β蛋白表達(dá)隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明放射線刺激后，直腸組織中TGF-β蛋白表達(dá)增多，從而促進(jìn)纖維化的進(jìn)程，病理形態(tài)學(xué)檢查也進(jìn)一步驗(yàn)證纖維化的形成。檢測(cè)直腸組織中NF-κB蛋白變化，可見核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)也隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提示TGF-β蛋白的表達(dá)可能會(huì)影響下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，TGF-β是放射性纖維化形成的關(guān)鍵因素，放射治療增加TGF-β蛋白表達(dá)，可能與促進(jìn)NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)錄有關(guān)。以TGF-β為靶點(diǎn)分析放射性纖維化的進(jìn)展和治療，為臨床治療提供了新的思路。

［1］Nierhoff J，Chávez Ortiz AA，Herrmann E，et al.The efficiency of acoustic radiation force impulse imaging for the staging of liver fibrosis:a meta-analysis［J］.Eur Radiol，2013，23(11):3040-3053.

［2］殷尉伯，谷銑之.腫瘤放射治療學(xué)［M］.3版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2003:52-56.

［3］Hamama S，Gilbert-Sirieix M，Vozenin MC，et al.Radiation-induced enteropathy:molecular basis of pentoxifylline-vitamin E antifibrotic effect involved TGF-β1 cascade inhibition［J］.Radiother Oncol，2012，105(3):305-312.

［4］Horton JA，Li F，Chung EJ，et al.Quercetin inhibits radiation-induced skin fibrosis［J］.Radiat Res，2013，180(2):205-215.

［5］Vera R，Trombetta M，Mukhopadhyay ND，et al.Long-term cosmesis and toxicity following 3-dimensional conformal radiation therapy in the delivery of accelerated partial breast irradiation［J］.Pract Radiat Oncol，2014，4(3):147-152.

［6］Zhuang H，Yuan Z，Chang JY，et al.Radiation pneumonitis in patients with non-small-cell lung cancer treated with erlotinib concurrent with thoracic radiotherapy［J］.J Thorac Oncol，2014，9(6):882-885.

［7］Ishimaru M，Yusuke N，Tsukimoto M，et al.Purinergic signaling via P2Y receptors up-mediates IL-6 production by liver macrophages/Kupffer cells［J］.J Toxicol Sci，2014，39(3):413-423.

［8］Satheeshkumar PS，Mohan MP，Jacob J.Restricted mouth opening and trismus in oral oncology［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2014，117(6):709-715.

［9］Thompson R，Giuliani M，Yap ML，et al.Stereotactic body radiotherapy in patients with previous pneumonectomy:safety and efficacy［J］.J Thorac Oncol，2014，9(6):843-847.

［10］Gao F，F(xiàn)ish BL，Szabo A，et al.Enhanced survival from radiation pneumonitis by combined irradiation to the skin［J］.Int J Radiat Biol，2014，14(8):1-42.

［11］Agrawal S.Late effects of cancer treatment in breast cancer survivors［J］.South Asian J Cancer，2014，3(2):112-115.

［12］Ishida K，Hirose T，Yokouchi J，et al.Phase II study of concurrent chemoradiotherapy with carboplatin and vinorelbine for locally advanced non-small-cell lung cancer［J］.Mol Clin Oncol，2014，2(3):405-410.