產木質素過氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測定

于德涵,黎 莉,蘇 適

（綏化學院食品與制藥工程學院,黑龍江綏化 152000）

產木質素過氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測定

于德涵,黎 莉,蘇 適

（綏化學院食品與制藥工程學院,黑龍江綏化 152000）

為獲得產木質素過氧化物酶的黑木耳菌株,從野外采集的37株黑木耳菌株中篩選產木質素過氧化物酶單株,最終得到2株目標菌株,并測定其產酶活力,2株黑木耳分泌Lip最高酶活力分別為0.021和0.035U·mL-1。

黑木耳；木質素過氧化物酶；篩選；酶活測定

木質素降解酶包括漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）和木質素過氧化物酶（Lip）,是微生物降解木質素的最主要也是最有效的酶類［1］。Lip分子內含亞鐵血紅素的過氧化物酶,具有較差的底物專一性,可和苯酚、芳香胺、芳香醚、多環芳香化合物等多種不同的木質素模型化合物反應,對木質素廣泛的分解特性使Lip在木質素的降解過程中發揮重要的作用。木質素降解酶是微生物分解植物纖維木質素的重要酶類,有證據顯示,多種食用菌胞外酶活力尤其是木質素降解酶的活力與其栽培產量呈正相關［2］。黑木耳（A.auricula-judae）的木質素降解酶體系中僅包括2種Lac和MnP,而僅有少量品種或菌株有木質素過氧化物酶產生［3-4］。因此,尋找或培育產木質素降解酶的黑木耳優良菌株,一方面有利于人們進一步了解該酶的特性,并為提高人工栽培黑木耳篩選優良菌種奠定物質基礎；另一方面更有利于黑木耳對秸稈、稻草等木屑替代栽培物的降解,提高秸稈、稻草等農田廢棄物的利用率,降低代料栽培黑木耳的成本,減少對森林資源的浪費。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為野生黑木耳菌種TH1～TH37,共37株,均采自黑龍江省伊春桃山林業局。

試劑有天青B（AzureB,美國Sigma公司）,其他試劑皆為國產分析純。主要儀器有752型紫外分光光度計、BILON-HW-10型恒溫水浴鍋、SIGMA2-16PK冷凍高速離心機、CLG-32L立式全自動高壓蒸汽滅菌器、PHS-3C型數顯pH計、DNP-9022-1型恒溫培養箱。

1.2 培養基的配制

PDA固體培養基。馬鈴薯洗凈、去皮、切成小塊,稱取200g,加1L蒸餾水,大火煮至沸騰后,改文火煮30min,八層紗布過濾,向濾液中加入20g葡萄糖,2.0gKH2PO4,1.0gMgSO4,15g瓊脂,充分攪勻后定容至1000mL［5］。

PDA液體培養基Ⅰ。配方與配制方法同去除瓊脂的PDA固體培養基。

PDA液體培養基Ⅱ。在PDA液體培養基I的基礎上,每1000mL培養基添加100g木屑。

檢測培養基。稱取酵母浸出物10.0g,葡萄糖10.0g,瓊脂20.0g,加蒸餾水600mL,加熱使其充分溶解,再加亮藍6.25g,用蒸餾水定容至1000mL。

所有培養基配制后,于0.1MPa、121℃滅菌20min,備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將保藏菌株接入PDA斜面培養基,于28℃培養4d后轉接1次,再于28℃培養7d,將其轉接到PDA平板培養基上28℃培養7d,待用。

1.3.2 過氧化物酶的檢測

在活化的菌種平板培養基和含亮藍的培養基上分別打直徑3mm的小孔,將含菌絲的菌塞接種于亮藍培養基的小孔內,每個菌種3次,置28℃恒溫培養,每隔24h觀察亮藍平板中接種菌落周圍是否出現變色圈,以有無變色圈的出現判斷是否有過氧化物酶的產生,有變色圈者記為“+”,反之則為“-”,并記錄顯色時間［6］。有變色圈出現的菌種分別在第7天測量菌絲圈（d1）和變色圈的直徑（d2）。

1.3.3 粗酶液的制備

在經活化且有木質素過氧化物酶檢出的菌種平板上,挑取適量菌絲分別接種于含250mLPDA液體培養基I和II的250mL三角瓶中,28℃靜置培養1d后,于28℃、130r·min-1恒溫搖床培養20d,第3天起,每天從培養液中吸取10mL發酵液單獨保存。所有發酵液于3000r·min-1離心15min,上清液即粗酶液I和II,保存于冰箱中備用。

1.3.4 木質素過氧化物酶的檢測

選取上述有變色圈出現的粗酶液I（培養7d）,于無菌條件下取3.5mL粗酶液,0.3mL 0.5mol·L-1的酒石酸鉀鈉緩沖液（pH值4.0）, 0.1mL1mmol·L-1的亞甲基藍溶液混合,再向體系中加入0.1mL4.5mmol·L-1的H2O2啟動反應。以滅活的粗酶液I（7d）反應體系作空白對照,若反應體系由淡藍綠色轉變為藍紫色,則表明有木質素過氧化物酶產生,否則無木質素過氧化物酶產生［7］。有顏色變化者用“+”標記,無顏色變化者用“-”標記。

1.3.5 木質素過氧化物酶的酶活力測定

對不同培養時間的粗酶液樣本進行酶活測定。在試管中加入2mL濃度為0.125mol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH值為3.0）、1mL濃度為0.16mmol·L-1的天青B溶液、1mL粗酶液I, 30℃恒溫水浴中保存5min后,向試管中再加入30℃2mmol·L-1H2O2溶液1mL啟動反應,精確計時。測量反應在最初3min內在651nm處的吸光度（D）的減小速率,以每分鐘每毫升粗酶液降低0.1個D值為1個酶活力單位［8-9］。每待測樣品平行操作3次,取平均值。以相同的方法檢測粗酶液Ⅱ中Lip酶活力。

2 結果與分析

2.1 過氧化物酶的檢測

在含亮藍的PDA平板培養基上接種3mm的菌絲,28℃下培養,每24h觀察1次。結果（表1）17個菌株有15個樣本培養基中出現變色圈。

表1 變色圈產生及菌絲圈和變色圈直徑變化

2.2 Lip檢測

將除TH4和TH33外的產生變色圈的菌株進行Lip檢測,反應體系變色情況如表2所示。

表2 木質素過氧化物酶檢測結果

2.3 Lip活力測定

利用天青B染料對分泌Lip的菌株進行酶活力測定。不同培養時間的發酵液濾液中Lip活力結果如圖1所示。

圖1 菌株不同培養時間的Lip活力變化

3 討論與小結

3.1 過氧化物酶的檢測

現階段,常用一些特定的顏色反應來檢測一個菌株是否具有降解木質素的能力,微生物若是能產生木質素降解酶尤其是過氧化物酶類,就能和培養基中的有效指示劑反應,產生特異的顏色變色圈,亮藍是檢測過氧化物酶的常用指示劑。在PDA培養基中添加適量亮藍,在接種部位有過氧化物酶產生則會在其周圍形成黃色的顯色圈,并且酶活力的強弱和黃色圈的大小正相關。變色圈的形成有兩種方式,一種是變色圈位于菌絲圈的內部,即d1＞d2（d1是菌絲圈直徑,d2是變色圈直徑）,另一種是變色圈在菌絲圈外部,即d1＜d2,二者是由于不同菌株間菌絲生長速度差異和分泌過氧化物酶能力的差異造成的［10］。

有研究表明,變色圈的實際面積的大小反映了酶對木質素降解能力的強弱,因此d2/d1可作為判定該微生物是否降解木質素的依據,如比值大于1,纖維素首先被降解；若比值小于1,則該微生物會首先選擇性地降解木質素,且比值越小,越說明單位菌株可能產生酶的能力及酶活力越強［11］。從檢測結果來看,待檢的37株菌株中有35株都有變色圈產生,而在第7天在對產生變色圈的菌落分別測定菌絲圈和變色圈,并計算二者比值的結果顯示,35株有過氧化物酶產生的菌株中,其d2/d1的值全部小于1,初步判斷應會優先降解木質素。試驗中,菌株TH6的d2/d1最小為0.062,表明該菌株可能降解木質素的能力最強。利用指示劑的變色圈反應,只是對氧化物酶的一種定性檢測方法,而具體的酶活力須經過定量檢測才能確定。

3.2 Lip的檢測

亞甲基藍是木質素降解酶的定性檢測指示劑,在有過氧化氫啟動反應的條件下,分泌Lip的菌株會使亞甲基藍溶液的顏色由藍綠色逐漸轉變為藍紫色。將初步判斷有過氧化物酶產生的菌株進行Lip檢測,檢測結果表明,35株菌株中僅有2株菌株（TH11和TH20）有Lip產生,其余菌株分泌的過氧化物酶成分可能為Mnp或其他。

3.3 Lip活力測定

現階段,對測定Lip活力的底物常用藜蘆醇（Veratrylalcohol,VA）或天青染料。在采用藜蘆醇作底物時,要使用pH為2.5的緩沖液,酶在此pH條件下容易失活,且該檢測方法還對溫度的穩定性有很高的要求,尤其是該法的檢測波長為310 nm,微生物代謝產生的酚和苯類物質都會對紫外的吸收產生影響［12-13］。測定Lip的天青多為天青B,其穩定性高,生物反應條件下不易被脫色,專一性好,和Lac及MnP都不起反應；另外,該方法的檢測波長為651nm,為可見光區,能夠避免芳香化合物對檢測的干擾,從而提高檢測的靈敏度［14-15］。研究表明,一般在液體發酵第3天開始,陸續有胞外酶分泌,培養7～9d酶活力基本能達到峰值［16］,故試驗在液體培養第3天開始進行活力測定,連續測定20d。測定結果顯示,菌株TH11在第7天活力達到0.021U·mL-1,隨后酶活力陡降；菌株TH20酶活隨培養時間的延長而快速升高,第8天最高,達到0.035U·mL-1,隨后也快速下降至接近無活性。而在培養基中添加木屑作為Lip的底物后,2個菌株達到最大酶活力的培養天數仍然是8d左右,但最大酶活力增加了3倍,分別達到0.057和0.096U·mL-1,且因為有底物的存在,酶活力在達到峰值后會在峰值保持2～3 d,而后因底物減少而緩慢下降,二者在培養20d后,仍有較低的酶活性。

試驗對37株野生黑木耳菌株進行篩選,從中得到2株分泌Lip的菌株,其酶活力分別為0.021和0.035U·mL-1,活力水平較低,但為后續培育產高效及高活力Lip菌種奠定物質基礎。

［1］ ChenYR,SarkanenS,WangYY.Lignin-degradingenzyme activities［M］//BiomassConversion.HumanaPress,2012：251-268.

［2］ XuJZ,ZhangJL,HuKH,etal.Therelationshipbetween ligninperoxidaseandmanganeseperoxidaseproduction capacitiesandcultivationperiodsofmushrooms［J］.Miccrob Biotechnol,2013,6（3）241-247.

［3］ PraveenK,ViswanathB,UshaKYetal.Lignolyticenzymes ofamushroomStereumostreaisolatedfromwoodlogs［J］. EnzymeRes,2011：749518.

［4］ PapinuttiVL,ForchiassinF.Enzymesofwhiterotfungi involvedinlignindegradation［J］.RevArgentMicrobiol, 2000,32（2）：83-88.

［5］ KirkTK,SchultzE,ConmnorsWJ,etal.Influenceof cultureparametersonligninmetabolismbyPhanerochaete chrysosporium［J］.ArchMicrobiol,1978,117：277-285.

［6］ 劉海進,李呂木.木質素過氧化物酶的研究進展［J］.中國飼料,2010（2）：20-22,26.

［7］ 張輝.木質素降解酶系研究新進展［J］.天津農業科學, 2006,12（3）：8-12.

［8］ 倪啟亮,王敦球,戚拓業.木質素降解酶的酶活測定方法探討［J］.廣西農學報,2008,28（4）：54-58.

［8］ YangJS,LiuW,NiJR.Isolation,identificationoflignindegradingbacteriaandpurificationofligninperoxidase［J］. EnvironmentalScience,2006,27（5）：981-985.

［10］ PuYW,ZhenHM,FengST,etal.Studyonthecondition ofproductionMn-preoxidase（Mnp）byPhanerochaete chrysosporiumMIG3.383［J］.Mycosystema,1998,17（3）：251-255.

［11］ LiYZ,GaoPJ,WangZN.Nutritionalregulationofsynthesis ofligninperoxidasebyPhanero-chaetechrysosporiumME-446［J］.ActaMicrobiologicaSinica,1994,34（1）：29-36.

［12］ MaoL,LuJ,GaoSetal.Transformationof17beta-estradiol mediatedbyligninperoxidase：theroleofveratrylalcohol［J］. ArchEnvironContamToxicol,2010,59（1）：13-19.

［13］ TienM,KirkTK.LignindegradationenzymefromP. chrysosporium［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1984, 1：2280-2284.

［14］ ShimadaM,HiguchiT.WoodandcellulosicChemistry［M］. NewYork,MarcelDekker,1990：557-619.

［15］ AroraDS,GillPK.Comparisonoftwoassayproceduresfor ligninperoxidase［J］.EnzymeMicrobTechnol,2001,28：602-605.

［16］ PatelVK,YadavKDS,SharmaJK,etal.Lignin peroxidasesofsomeindigenousligninolyticfungi：secretionand enzymaticcharacteristics［J］.IndianJMicrobiol,2010,50（1）：132-138.

（責任編輯：張瑞麟）

Q554.9

B

0528-9017（2014）02-0204-04

文獻著錄格式：于德涵,黎莉,蘇適.產木質素過氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測定［J］.浙江農業科學,2014（2）：204-207.

2013-10-22

綏化學院科研項目（KQ1202008）

于德涵（1982-）,男,黑龍江綏化人,講師,碩士,從事食用菌胞外酶及分子生物學的研究工作。E-mail：Yudehan @163.com。