薄層色譜生物自顯影法篩選新疆莫合煙天然乙酰膽堿酯酶抑制劑的活性成分＊

王 健，朱萍萍，倪國(guó)柱，溫琳豫，支 玲，胡曙晨

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011)

吸煙有害健康，戒煙是世界趨勢(shì)。一般都認(rèn)為，煙堿是煙草中的主要毒性物質(zhì)，但流行病學(xué)研究報(bào)告顯示，吸煙可降低阿爾茨海默病(AD)和帕金森綜合征(PD)的發(fā)病率。一些試驗(yàn)和臨床研究結(jié)果也顯示，煙堿可預(yù)防并治療AD 和PD，這引起了人們的廣泛重視[1-3]。AD 的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但獲得最廣泛支持的膽堿能學(xué)說(shuō)和β-淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)都表明，乙酰膽堿酯酶(AChE)和AD 的形成密切相關(guān)，會(huì)從多方面加重AD 患者的癥狀。目前，抑制AChE 活性從而間接增強(qiáng)膽堿能活性，仍然是治療AD 最有效的方法。現(xiàn)階段尋找天然的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)多采用先分離后測(cè)定活性的方法。按照傳統(tǒng)方法，從提取植物浸膏到分離出化合物并解析出正確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，往往耗費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年。因此，建立更快捷、更準(zhǔn)確的天然AChEI 跟蹤分離方法成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究目標(biāo)。近年來(lái)，薄層色譜生物自顯影技術(shù)逐漸被用于天然AChEI 的跟蹤分離[4-5]。雖然煙草中的煙堿用于預(yù)防和治療AD 的機(jī)理尚未完全闡明，且學(xué)術(shù)界對(duì)是否能使用煙堿治療AD 存在爭(zhēng)議，但筆者認(rèn)為，仍有必要通過(guò)薄層色譜生物自顯影技術(shù)分離新疆莫合煙中天然AChEI，探明其中是否存在這些成分，從而為后期的開(kāi)發(fā)研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器:KQ-500DE 型超聲波清洗器(500 W，40 kHZ，昆山市超聲儀器有限公司);半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG Linomat 5);薄層色譜數(shù)碼成像儀(CAMAG REPOSTAR3);臺(tái)式離心機(jī)(Thermo Scientific Multifuge X3R);分析天平(Mettler -Teledo AB135 -S，d=0.01/0.1 mg);磁力攪拌油浴槽(東京理化EYELA PS-1000);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[EYELA N-1001S-WA(D)];pH 計(jì)(Sartorius PB-10);硅膠G 高效板(青島海洋化工廠);雙槽展開(kāi)缸(20 cm×10 cm)。

試藥:2，2 -二苯基苦基苯肼自由基(2，2-Diphenyl-1 -picrylhydrazyl，DPPH，批號(hào)為STBC1252V，ALDRICH 公司);乙酰膽堿酯酶(AChE，Sigma 公司，批號(hào)為041M7009V);固藍(lán)鹽B(中國(guó)醫(yī)藥＜集團(tuán)＞上海化學(xué)試劑公司);三羥基氨基甲烷(Tris，批號(hào)為110108)，牛血清白蛋白(BSA，批號(hào)為110913)，均為上海藍(lán)季科技發(fā)展公司產(chǎn)品;乙酸-α-萘酯(AR，天津市光復(fù)精化工研究所);無(wú)水碳酸鈉(AR，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司);甲苯(AR)，甲醇(AR)，醋酸乙酯(AR)，二乙胺(AR)，均為天津福晨精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品;無(wú)水乙醇(AR，天津市登科化學(xué)試劑有限公司);氯仿(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);濃氨水(AR)，濃硫酸(AR，98%)，均為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。新疆莫合煙原產(chǎn)自新疆伊犁地區(qū)，2010 年購(gòu)買(mǎi)于烏魯木齊市場(chǎng)。煙堿(批號(hào)為20110515，純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司);石杉?jí)A甲(批號(hào)為20110411，上海源葉生物科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 莫合煙提取液制備

用1%的稀硫酸以料液比1 ∶6 和1 ∶5 分別對(duì)新疆莫合煙水浴回流1 h，合并2 次提取液于蒸發(fā)皿中，50 ℃水浴蒸干，制成粗浸膏，取200 mg 浸膏，溶于1 mL 甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為200 g/L 的莫合煙水提取液，備用[6]。取新疆莫合煙20 g，加入甲醇100 mL 和10% 無(wú)水Na2CO320 mL，水浴回流10 min 后，在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至移出液體體積的1 /10，離心后取上清液，得到莫合煙醇提取液Ⅰ。再分別取醇提液Ⅰ2，4，8 mL，置3 個(gè)10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，離心后取上清液，得到莫合煙醇提取液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ[7]。

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液:精密稱取石杉?jí)A甲對(duì)照品2 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.2 g/L)。精密稱取煙堿對(duì)照品200 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為20 g/L)。

乙酰膽堿酯酶溶液[4]:取乙酰膽堿酯酶AChE 500 U 溶解于Tris-HCl 緩沖液(pH=7.8)500 mL 中，加入牛血清白蛋白(BSA)500 mg 以保持酶溶液的穩(wěn)定，得1.0 U/mL 的乙酰膽堿酯酶溶液。此溶液可在4 ℃保持活性達(dá)6 個(gè)月。

顯色劑[4]:精密稱取乙酸-α-萘酯150 mg，置100 mL 容量瓶中，加40 mL 無(wú)水乙醇溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.5 g/L 的乙酸-α-萘酯溶液。精密稱取固藍(lán)鹽B 50 mL，置100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的固藍(lán)鹽B 溶液。

DPPH 溶液[8]:精密稱取DPPH 7.78 mg，用甲醇定容于100 mL 容量瓶中，制成DPPH 溶液(質(zhì)量濃度為0.2 mmol/L)，避光(0 ～4 ℃)保存。

2.3 展開(kāi)與顯色

抗乙酰膽堿酯酶薄層色譜自顯影法[4，9]:分別吸取石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液3 μL，莫合煙水提取液5 μL 和10 μL，煙堿對(duì)照品0.9 μL，點(diǎn)于同一高效G 板上。以乙酸乙酯-甲醇-濃氨水(7 ∶3 ∶0.1)為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)后用吹風(fēng)機(jī)將板子完全吹干，不能殘留任何有機(jī)溶劑。噴1.0 U/mL 的乙酰膽堿酯酶溶液，冷風(fēng)快速吹至板子上無(wú)液體流動(dòng)，再噴40%乙醇配制的乙酸-α-萘酯溶液(1.5 g/L)，也快速吹至板子上無(wú)浮液。在37 ℃恒溫水浴鍋中放一小鐵架，將板子架在架子上，不接觸到水，然后將皿蓋蓋好，溫?zé)?0 min 后取出板子，噴固藍(lán)鹽B 溶液(0.5 g/L)。如果樣品有乙酰膽堿酯酶抑制活性，即可觀察到紫色背景下有白色的抑制劑斑點(diǎn)。分別記錄薄層板顯色前后自然光、紫外光254 nm、紫外光366 nm 波長(zhǎng)下的照片，見(jiàn)圖1。

圖1 抗乙酰膽堿酯酶薄層色譜生物自顯影圖

圖2 DPPH 顯色法薄層色譜圖

DPPH 顯色法:分別吸取莫合煙醇提取液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅰ各10 μL，石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液3 μL，點(diǎn)于同一高效G 板上。以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(7 ∶2 ∶1)為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)后噴0.2 mmol/L DPPH 溶液顯色。如果存在抗氧化活性，可在淡紫色背景下看到白色至黃色斑點(diǎn)。分別記錄薄層板顯色前后自然光下照片，見(jiàn)圖2。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

筆者之前的試驗(yàn)研究測(cè)得，莫合煙中總生物堿含量為1.71%[8]。通過(guò)對(duì)比抗乙酰膽堿酯酶薄層色譜自顯影法中紫色背景下白色斑點(diǎn)的大小，證實(shí)煙堿可與抗乙酰膽堿酯酶結(jié)合并降低其活性;但在莫合煙提取液中與煙堿對(duì)照品相應(yīng)位置處沒(méi)有出現(xiàn)抗乙酰膽堿酯酶的顯著白色斑點(diǎn)，加大點(diǎn)樣液質(zhì)量濃度或點(diǎn)樣量也無(wú)改善，證實(shí)莫合煙提取液中的煙堿含量無(wú)法達(dá)到顯著的抑制濃度，較石杉?jí)A甲對(duì)照品活性偏低。通過(guò)DPPH 顯色法點(diǎn)樣展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)莫合煙提取液抗氧化活性較好，清除DPPH 的白色至黃色抗氧化斑點(diǎn)隨提取液質(zhì)量濃度加大而加大;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，莫合煙提取液中不只一種成分具有較顯著的抗氧化活性。

3 討論

煙堿作為N 膽堿受體激動(dòng)劑的代表，小劑量激動(dòng)受體，大劑量阻斷受體[10]，是公認(rèn)的煙草致癮并導(dǎo)致其戒除困難的元兇，但煙堿在長(zhǎng)期吸煙者身上也表現(xiàn)出了降低退行性疾病發(fā)病率的作用。首先，煙堿容易進(jìn)入中樞系統(tǒng)，通過(guò)興奮nAChR 增加多巴胺、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并通過(guò)α4β2nAChRs 和PI3K-Akt通路對(duì)中樞神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，免受興奮性氨基酸谷氨酸產(chǎn)生的神經(jīng)毒性毒害[11];其次，煙堿進(jìn)入中樞后，可與乙酰膽堿酯酶結(jié)合而降低腦內(nèi)的乙酰膽堿酯酶水平，從而對(duì)記憶和學(xué)習(xí)功能有所改善;另外，煙草中存在的抗氧化物質(zhì)可能也會(huì)對(duì)預(yù)防退行性疾病產(chǎn)生作用[12]。

由于上述或其他還未闡明的原因，長(zhǎng)期吸煙者退行性疾病的發(fā)病概率低于不吸煙者的現(xiàn)象能夠得到解釋。但煙草未經(jīng)點(diǎn)燃與點(diǎn)燃吸入，內(nèi)含物的結(jié)構(gòu)與形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，煙草實(shí)際的煙堿含量、煙草提取物(液)中的煙堿含量及吸入人體后的煙堿含量，甚至短期吸入與長(zhǎng)期吸入的煙堿含量必然存在差異，其量效關(guān)系需要嚴(yán)格的藥理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。本研究中所確立的薄層色譜生物自顯影方法，可在大規(guī)模動(dòng)物試驗(yàn)前篩選各類(lèi)煙草及煙草制品，通過(guò)白色斑點(diǎn)的有無(wú)、白色斑點(diǎn)的深淺，高靈敏度和專(zhuān)屬性地定性煙堿含量是否達(dá)到顯著抑制乙酰膽堿酯酶的水平，從而為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。薄層色譜生物自顯影作為一種將薄層色譜分離和生物活性測(cè)定相結(jié)合的藥物篩選方法，是一種快速測(cè)定方法，應(yīng)用于天然AChEI 的篩選，值得推廣。

同時(shí)，如何協(xié)調(diào)煙堿成癮與阻斷乙酰膽堿酯酶受體的劑量，如何以煙堿為母體對(duì)其系列衍生物進(jìn)行抗乙酰膽堿酯酶作用機(jī)制的研究，并且最終在煙堿替代療法中達(dá)到戒煙與預(yù)防退行性疾病共贏的目標(biāo)，可以為我國(guó)煙草行業(yè)的發(fā)展提供一個(gè)有益的思路，探求新的發(fā)展機(jī)遇。

通過(guò)薄層色譜生物自顯影方法對(duì)新疆莫合煙進(jìn)行活性篩選發(fā)現(xiàn)，莫合煙中的煙堿具有抗乙酰膽堿酯酶活性，但提取液中的煙堿含量達(dá)不到顯著抑制濃度;莫合煙提取液的抗氧化活性較強(qiáng);薄層色譜生物自顯影是值得推廣，可應(yīng)用于天然AChEI 活性篩選的技術(shù)。因此，將薄層色譜生物自顯影技術(shù)廣泛應(yīng)用于煙草、煙草制品及其他潛在藥物的抗乙酰膽堿酯酶活性的體外篩選，是進(jìn)行大規(guī)模動(dòng)物試驗(yàn)前的一個(gè)有益嘗試。

致謝:本研究得到了新疆醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心主任李新霞教授的悉心指導(dǎo)。

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