溶血及宮頸黏液對人乳頭狀瘤病毒DNA檢測結(jié)果的影響

謝秋華 有 軍

浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200135

人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的主要因素[5，7]。目前Real-time PCR 技術(shù)廣泛被實(shí)驗(yàn)室用于檢測HPV 感染[4，6，8]，用于檢測HPV 的宮頸脫落細(xì)胞樣本，即使嚴(yán)格按照采樣規(guī)范進(jìn)行樣本采集，但收集到的樣本仍不可避免地混有血液或?qū)m頸黏液。本研究通過對含不同濃度血紅蛋白（hemoglobin，Hb）或?qū)m頸黏液的宮頸脫落細(xì)胞樣本，采用Real-time PCR 法進(jìn)行檢測，探討溶血及宮頸黏液對HPV DNA檢測結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年9月—2013年5月內(nèi)本院婦科門診就診的女性患者宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本作為研究對象。選取其中HPV 檢測為陽性的標(biāo)本進(jìn)行研究，患者年齡19～53歲，平均年齡（34.3±8.2）歲，其中隨機(jī)抽取10例未溶血且不含宮頸黏液的陽性樣本作為溶血組初始樣進(jìn)行試驗(yàn)，10例未溶血而富含宮頸黏液的陽性樣本作為黏液組初始樣本進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀為ROCHE Lightcycler1.2;核酸的抽提、擴(kuò)增及檢測試劑購自港龍生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3 樣本采集和分組

所有樣本均經(jīng)被采集本人知情同意，嚴(yán)格按照宮頸脫落細(xì)胞樣本采集規(guī)范采集，采集后樣本盡快送檢，4℃保存不超過1 d，-20℃保存不超過6 個(gè)月。溶血試驗(yàn)組樣本為未溶血且不含宮頸黏液的陽性樣本，黏液組試驗(yàn)樣本為未溶血而富含宮頸黏液的陽性樣本。

1.4 溶血樣本的制備

取本實(shí)驗(yàn)室收到的多個(gè)宮頸脫落細(xì)胞重度溶血樣本，檢測其Hb 濃度以確定所制備溶血樣本的Hb 濃度范圍，檢測得到Hb 濃度＜5 g/L，故溶血樣本Hb 濃度取5 g/L 和10 g/L。

取一份女性健康體檢的志愿者EDTA-K2 抗凝的“O”型全血樣本4 mL，加入15 mL 離心管，2000 g 離心5 min 后吸棄血漿，加入10 mL 無菌生理鹽水并震蕩混勻，2000 g 離心5 min 后去上清，重復(fù)洗滌2 次。加入2 mL 無菌生理鹽水懸浮紅細(xì)胞，測定懸液Hb 濃度，然后用無菌生理鹽水稀釋成相應(yīng)度濃度的紅細(xì)胞懸液，-30 ℃與常溫10 min 凍融1 次，制成含部分未裂解紅細(xì)胞的Hb 懸液。

取初始樣本500 μL/份1:1 加入Hb 懸液并混勻，得到Hb 終濃度不同而HPV 含量相同的模擬溶血樣本。未溶血組為500μL 初始樣本加500 μL 無菌生理鹽水（Hb 為0 g/L），溶血組為500 μL初始樣本加入500 μL Hb 懸液，Hb 終濃度分別為5 g/L 和10 g/L。

1.5 宮頸黏液樣本的處理

樣本分為黏液未處理組、凍融解黏組和NaOH 解黏組進(jìn)行檢測。黏液未處理組組取500 μL 初始樣本；凍融解黏組取初始樣本500 μL 經(jīng)凍融解黏處理；NaOH 解黏組取500 μL 初始樣本加入500 μL NaOH（0.1 mol/L）進(jìn)行處理。

1.6 HPV DNA 檢測步驟

主要檢測步驟包括HPV DNA 提取，PCR 擴(kuò)增檢測，每一步均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.7 結(jié)果判斷

以PCR 擴(kuò)增檢測得到的HPV DNACt 值進(jìn)行判斷：無數(shù)值報(bào)高危型HPV 陰性；Ct 值小于37 報(bào)高危型HPV 陽性；Ct 值在37～40 之間，復(fù)檢；重新檢測結(jié)果Ct 值＜40 報(bào)高危型HPV 陽性，無Ct 值報(bào)高危型HPV 陰性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS 8.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：定量資料采用（）表示，行隨機(jī)區(qū)組的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶血對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值結(jié)果的影響

為了觀察溶血對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值結(jié)果的影響，在初始樣本中分別加入生理鹽水和Hb 懸液，制成Hb 終濃度為0、5、10 g/L的溶血樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Hb 濃度由0 g/L 增加至10 g/L，三組對HPV DNA 擴(kuò)增檢測Ct 值結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.96，P=0.4019），見表1。

表1 溶血對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值的影響

2.2 宮頸黏液對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值結(jié)果的影響

為了觀察宮頸黏液對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值結(jié)果的影響，按是否進(jìn)行解黏處理分為黏液未處理組、凍融解黏組和NaOH 解黏組進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組間Ct 值結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.28，P＜0.0001）；其中凍融解黏組和NaOH 解黏組Ct 值結(jié)果與黏液未處理組相比，Ct 值結(jié)果減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而凍融解黏組與NaOH 解黏組相比，Ct 值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

表2 宮頸黏液對HPV DNA 擴(kuò)增Ct 值的影響

3 討論

目前HPV DNA 檢測被廣泛應(yīng)用于臨床檢測，而檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性往往與病毒核酸的提取及樣本的性質(zhì)密切相關(guān)。在樣本采集過程中盡管已嚴(yán)格按照操作規(guī)程如避開婦女的月經(jīng)期等，但在某些情況下采集到的樣本依然不可避免地出現(xiàn)混有血液或者宮頸黏液等現(xiàn)象。本研究通過Real-time PCR 技術(shù)對宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行HPV DNA 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶血對結(jié)果不產(chǎn)生影響，宮頸黏液經(jīng)凍融或NaOH 解黏化處理后能減少黏液對檢測的干擾，降低復(fù)檢率。

Hb 中的血紅素可抑制DNA 聚合酶的活性，降低熒光定量PCR 檢測結(jié)果，甚至出現(xiàn)假陰性[3]。伍金華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在用導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)檢測人乳頭狀瘤病毒分型過程中，Hb 對該檢測結(jié)果沒有影響。在本研究中，當(dāng)Hb 終濃度分別為0、5、10 g/L時(shí)，HPV DNA 的Ct 值的變化不大，結(jié)果表明檢測Hb 亦不結(jié)果影響Real-time PCR 技術(shù)對宮頸脫落細(xì)胞樣本的HPV DNA 檢測。

宮頸黏液的多少與婦女生理性周期性的變化或病理變化相關(guān)，采樣過程中并不能完全杜絕樣本帶有黏液情況的出現(xiàn)。陳鳳等[1]研究顯示，第2 代雜交捕獲法檢測HPV DNA，其檢測結(jié)果不受樣本帶有分泌物的影響，而伍金華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)檢測人乳頭狀瘤病毒時(shí)，有黏液組標(biāo)本復(fù)檢率高于無黏液組。因DNA 相對耐堿且宮頸黏液樣本-30℃凍存一定時(shí)間后復(fù)融會發(fā)生解黏現(xiàn)象，本研究中對宮頸黏液進(jìn)行凍融或NaOH 處理以達(dá)到解黏目的。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與黏液未處理組相比，凍融解黏組、NaOH 解黏組Ct 值結(jié)果減小（P＜0.05），表明解黏有助于HPV DNA 的檢測。本研究所中對含宮頸黏液樣本的經(jīng)凍融或加NaOH 進(jìn)行解黏處理后，需復(fù)檢的樣本數(shù)由3/10 降為0/10，降低了樣本的復(fù)檢率。探討其原因有①樣本吸樣及離心后去上清過程中受到宮頸黏液特影響，可能造成上皮細(xì)胞的丟失或稀釋，進(jìn)而影響檢測結(jié)果。②抽提過程中，樣本中含有的黏液使上皮細(xì)胞未能充分裂解并釋放病毒，從而影響抽提效果。③黏液樣本中可能含有較多的內(nèi)源性抑制物如黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等，可能干擾核酸提取或者抑制聚合酶活性。

綜上所述，Real-time PCR 法檢測HPV DNA 時(shí)，溶血與否不影響該方法對宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV DNA 的檢測結(jié)果；對宮頸黏液進(jìn)行凍融或NaOH 解黏處理后可有效清除黏液對檢測的干擾，降低復(fù)檢率。對于宮頸黏液合并溶血的樣本是否對檢測結(jié)果有影響，尚待進(jìn)一步研究。

[1]陳鳳，沈艷紅，劉彬，等.第二代雜交捕獲法檢測子宮頸瘤人乳頭瘤病毒影響因素的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85(2)：129-130.

[2]伍金華，吳艷梅，牛映紅.血紅蛋白和宮頸黏液對人乳頭狀瘤病毒分型的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2012；9(10)：1180-1182.

[3]Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al.Identification of heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from Bloodstains，a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification [J].J Forensic Sic，1994，39（2）：362-372.

[4]Castle PE，Stoler MH，Wright TC Jr et al.Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older:a subanalysis of the ATHENA study[J].Lancet Oncol，2011，12(9)：880-890.

[5]Dalstein V，Briolat J，Birembaut P，et al.The epidemiology of genital human papillomavirus infections[J].Rev Prat，2006，56 (17)：1877-1881.

[6]Depuydt CE，Benoy IH，Beert JF，et al.Clinical Validation of a Type-Specific Real-Time Quantitative Human Papillomavirus PCR against the Performance of Hybrid Capture 2 for the Purpose of Cervical Cancer Screening[J].J Clin Microbiol，2012，50 (12)：4073-4077.

[7]Du J，Nsman A，Carlson JW，et al.Prevalence of human papillomavirus(HPV) types in cervical cancer 2003-2008 in Stockholm，Sweden，before public HPV vaccination[J].Acta Oncol，2011，50(8)：1215-1219.

[8]Jentschke M，Soergel P，Lange V，et al.Evaluation of a new mμLtiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection of human papillomavirus infections in a referral popμLation [J].Int J Gynecol Cancer，2012，22(6)：1050-1056.