血紅素氧合酶-2基因真核表達載體的構建

張騰業，王珍珍，陳仁金，袁紅花，胡安康，吳連連，朱裕華，冀德君，朱孝榮＊

（1.徐州醫學院 神 經生物研究中心，江蘇 徐 州221004；2.徐州醫學院 實 驗動物中心，江蘇 徐 州221004；3.揚州大學 動 科學院，江蘇 揚 州221005）

血紅素氧合酶（HO）是血紅素降解的限速酶，能將血紅素轉變為氣態信號分子CO和抗氧化劑膽紅素和鐵［1］，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，主要分布于神經細胞和內皮細胞中。血紅素氧合酶-2（HO-2）是一種結構型血紅素氧合酶，是生理狀態下HO的主要存在形式，主要起催化作用。隨著對HO-2逐漸深入研究，其生物特性和作用機制逐漸被發現。

研究表明HO-2上調HO-1的表達，并對HO-1功能發揮起重要作用［2-3］。在體外試驗中，小鼠大腦血管內皮細胞中HO-2基因的缺失能夠誘導細胞調亡［4］，此外HO-2也是急性炎癥反應修復中的一種關鍵酶，對抗氧化應激和細胞凋亡有拮抗作用。而TLR4是Toll樣受體家族的成員的一種，當TLR4受到刺激后能引起下游的MyD88、NF-k B等的改變，調節炎癥反應和細胞凋亡［5］，TLR4缺失時能減少炎癥遞質的釋放及細胞凋亡［6］。由此我們推測HO-2可能通過調節TLR4通路調控細胞炎癥反應和凋亡。因此構建了它的真核表達載體，為后續的試驗工作做準備。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

C57BL／6小鼠由徐州醫學院實驗動物中心提供。真核表達載體p EF1α-IRES-AcGFP、小鼠腦血管內皮細胞由徐州醫學院神經生物學研究中心保存，限制性內切酶EcoR I和Bam H I、Taq酶、T4 DNA 連 接 酶、SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus）、DH5α感受態細胞、反轉錄試劑盒及TRIzol試劑，均購自Ta KaRa公司；質粒提取試劑盒，Promega公司生產；凝膠回收試劑盒、Dnase I，Invitrogen公司生產；……