光子晶體編碼液相芯片技術與腫瘤篩查*

楊子學 陳寶安 顧忠澤

惡性腫瘤已成為發(fā)展中國家的首位死因及發(fā)達國家的第二死因，早期篩查、早期診斷和早期治療是提高治愈率的關鍵。腫瘤標志物檢測是惡性腫瘤早期篩查的重要組成部分，尤其是多個腫瘤標志物的聯(lián)合檢測可提高診斷率。然而，目前臨床上此類檢測大多采用單指標方法，若應用于腫瘤篩查，不僅成本高，且費時費力，不易推廣［1］。

液相芯片技術是20世紀末發(fā)展起來的一種多元分析技術，具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，有望成為新一代的腫瘤篩查方法［2］。液相芯片由編碼微球、探針分子、目標分子和報告分子四部分組成。商用的編碼微球主要通過熒光進行編碼，但該編碼方式存在熒光易淬滅而導致的編碼丟失或誤編碼等問題。2002年Cunin等［3］開發(fā)了多孔硅光子晶體薄膜編碼載體；2006年Zhao等［4-5］制備出了自組裝光子晶體微球。這些研究工作使光子晶體成為一種新的編碼方式。該編碼方式不僅解決了液相芯片中載體編碼的穩(wěn)定性問題，而且由于其熒光背景低，提升了檢測靈敏度。光子晶體編碼液相芯片已逐漸在腫瘤標志物分析中嶄露頭角。

1 基于光子晶體編碼微球的液相芯片技術

液相芯片的四個組成部分中，編碼微球是核心技術。目前常見的編碼方式有光學編碼、圖形編碼、物理編碼、化學編碼等［6］。其中光學編碼最受關注，包含熒光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼等。本文介紹的光子晶體是一種由單分散納米粒子自組裝所形成的具有周期結構的材料。這類材料的光學反射特性可以通過納米結構進行調制［7］。光子晶體編碼可以通過兩種方式進行解碼，分別是依靠裸眼的顏色識別以及利用光譜儀的反射峰檢測。前者不需儀器即可進行多元分析，簡單方便，而后者則可實現(xiàn)高通量檢測。

探針分子在微球表面的連接數(shù)量及穩(wěn)定性直接關系到檢測方法的靈敏度與重復性。光子晶體微球表面連接探針分子的方法包括硅烷偶聯(lián)法（GPTMS法、APTES-戊二醛法）和碳二亞胺縮合法，這些方法具有穩(wěn)定性好，對探針分子活性影響小等優(yōu)點［8-12］。

1.1 蛋白腫瘤標志物分析

血清腫瘤標志物的檢測是目前最常用的腫瘤篩查方法，臨床多采用數(shù)種標志物聯(lián)合檢測的策略以提高檢出率。甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）以及多種糖類抗原都是我國高發(fā)惡性腫瘤的血清標志物，其檢測方法的確立也是光子晶體編碼液相芯片的研究重點。

1.1.1 基于二氧化硅膠體晶體微球的標記檢測 二氧化硅膠體晶體微球（Silica Colloidal Crystal Beads，SCCBs）是一種由單分散二氧化硅納米粒子自組裝而成的光子晶體微球（圖1）。目前，SCCBs主要采用玻璃微流體芯片進行制作，該方法快速便捷，產(chǎn)量大，得到的微球尺寸均一，有益于提高檢測的重復性［13］。掃描電鏡（SEM）圖片顯示，微球的表面粗糙，故其比表面積比同尺寸的普通微球大，有利于提高檢測靈敏度［14］。目前，十數(shù)種特征峰位置均勻分布于可見光區(qū)的光子晶體微球已經(jīng)可以被制備，而且在保證良好球形度的前提下，微球的直徑可以控制在約40～300 μm（圖2）。實驗中采用的微球直徑通常在180～250 μm。

圖1 A.SCCBs的SEM圖片；B.SCCBs表面細節(jié)的放大SEM圖片Table1 A.The SEM image of SCCBs；B.The enlarged image of surface details of SCCBs

圖2 SCCBs的光鏡照片和特征性反射峰［15］Table2 Light micrograph of the SCCBs and distinct reflection peak

標記檢測是一種常規(guī)檢測方法，它利用不同的報告分子產(chǎn)生差異性檢測信號，實現(xiàn)定量分析目標分子的目的。基于SCCBs的標記檢測主要采用熒光染料和酶辣根過氧化物酶（HRP）作為標記物［8，11-12］；前者操作簡便，使用的儀器也比較簡單，但熒光易猝滅，需要避光操作；后者是化學發(fā)光方法的催化劑，可獲得比熒光方法更高的靈敏度，但對檢測儀器的要求較高。

采用基于SCCBs的熒光分析方法，AFP和CEA的檢測靈敏度可分別達到0.68 ng/mL和0.95 ng/mL［8］。然而，隨著熒光染料的更新?lián)Q代，其強度及穩(wěn)定性都不斷提高，熒光分析法的檢測靈敏度也將會進一步提升。

Pei等［11］建立了基于SCCBs的化學發(fā)光分析方法，相比于熒光分析方法，該方法具有更高的靈敏度，AFP和CEA的檢測限可分別達到0.16 ng/mL和0.12 ng/mL，同時完成了25例臨床血清樣本的檢測，將所得結果與電化學發(fā)光參考方法的結果進行了比較。數(shù)據(jù)顯示兩種方法的結果沒有明顯差異，驗證了基于SCCBs化學發(fā)光分析方法的準確性。

1.1.2 基于硅水凝膠復合材料光子晶體微球的標記檢測 SCCBs可以通過微流控技術量產(chǎn)，是產(chǎn)業(yè)化光子晶體編碼液相芯片的首選載體。但在高靈敏度蛋白檢測中，隨著反應時間的延長，SCCBs的孔隙結構使得非特異性吸附明顯增多，需要增加洗滌強度和時間以去除，使實驗過程繁瑣。Yang等［9］采用聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEG-DA）水凝膠填充SCCBs孔隙結構的方法降低非特異性吸附，同時引入羧基功能基團連接蛋白抗體，縮短了微球前處理時間，并避免了接觸芳香族試劑，明顯提高了實驗的可操作性，同時檢測靈敏度也能夠滿足AFP和CEA的檢測要求。

1.1.3 基于反蛋白石結構光子晶體微球的非標記檢測 反蛋白石結構光子晶體微球是以SCCBs為模版，在二氧化硅納米粒子間隙填充高折射率的水凝膠材料后，除去模版所得到的光子晶體微球，結構如圖3所示［7］。光子晶體微球的特征性反射峰位置與其微球體系內部物質的平均折射率相關，當其內部成分發(fā)生改變時，特征性反射峰位置也隨之變化。利用這一特性可實現(xiàn)基于反蛋白石結構光子晶體微球的非標記檢測。Zhao等［16］將生物分子分散在水凝膠中，填充SCCBs后將模版去除，留下特殊結構的空隙（圖4）。這些空隙只接受相同或具有類似空間結構的生物分子進入，使微球的反射峰發(fā)生紅移，根據(jù)波峰的移動量即可確定目標分子的含量（圖5）。這種分子印跡方法在腫瘤標志物多元檢測中具有穩(wěn)定性好、載體易于保存的優(yōu)點。

圖3 A.反蛋白石結構水凝膠光子晶體微球的SEM照片；B.反蛋白石結構水凝膠光子晶體微球表面細節(jié)的放大SEM照片［17］Table3 A.SEM micrograph of the inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel；B.Magnified image of the surface details of the inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel

圖4 可用于非標記分析的反蛋白石結構水凝膠微球的制作方法［16］Table4 Preparation of inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel used in the unlabeled analysis

圖5 隨著目標物濃度的增大，水凝膠微球的反射峰逐漸紅移［16］Table5 Gradual red shifting of the reflection peak of hydrogel microspheres with increasing target object concentrations

除分子印跡法外，在水凝膠微球內部連接抗體以捕捉目標分子，也可改變平均折射率和反射峰位置，從而實現(xiàn)非標記檢測。Zhao等［17］利用這一方法實現(xiàn)了CA-199和CA-125兩種糖類抗原的多元分析，CA-199的最低檢出限為50 U/mL。

1.2 基因腫瘤標志物的檢測

隨著基因組學的發(fā)展，越來越多的腫瘤相關基因標志物被發(fā)現(xiàn)和應用。基于光子晶體編碼微球的液相芯片技術不僅可用于蛋白質標志物多元分析，也可用于基因標志物的多元分析。

1.2.1 基于SCCBs的標記檢測 腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導致化療失敗的主要原因之一，多藥耐藥基因1（MDR1）和多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）是與腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關的兩個基因。Yang等［10］篩選確定了這兩個基因的特征性擴增片段。這兩個片段具有相同的擴增條件，可以在同一個反應體系中完成PCR擴增，有利于同時分析兩個基因的表達情況。經(jīng)過擴增的反應液通過基于SCCBs的雙探針雜交實驗可明確擴增前的片段濃度。同時，K562和K562/A02細胞株的分析以及與熒光定量PCR方法的比對被用于驗證該檢測方法的可行性及準確性。結果顯示，耐藥株細胞的MDR1的表達高于非耐藥株大約1 000倍，且兩種方法的結果較為一致。

1.2.2 基于反蛋白石結構光子晶體微球的標記檢測 相比于SCCBs，反蛋白石結構水凝膠光子晶體微球具有更大的比表面積和更加疏松的內部結構，有利于提高檢測靈敏度，去除非特異性吸附（圖3）。Zhao等［20］以反蛋白石結構水凝膠光子晶體微球為載體，進行DNA片段的標記檢測。片段不經(jīng)擴增，檢測限可以達到IE-12 M。然而，該方法在實際操作中不能獨立存在，須依賴于PCR擴增技術。

2 光子晶體編碼技術的改進

為了方便檢測，光子晶體的特征性反射峰一般落在可見光區(qū)域（350～770 nm）。所以在保證分辨率的情況下，編碼數(shù)量會受到限制，只能實現(xiàn)中低通量的生物分子檢測。如果要開展高通量的生物分子篩查，必須與其他的編碼方式結合，構建聯(lián)合編碼，其中一種策略是將光子晶體編碼和量子點編碼進行結合［21］。聯(lián)合編碼可極大地增加編碼數(shù)量，實現(xiàn)更高通量篩查。

3 展望

光子晶體編碼微球為液相芯片技術提供了穩(wěn)定的編碼，簡易的解碼方式，為腫瘤篩查提供了靈活多變的多元分析技術，在腫瘤預防診斷工作中具有廣闊的應用前景。作為一種新興檢測技術，提高檢測的重復性，簡化及規(guī)范化實驗流程，是光子晶體編碼液相芯片亟待解決的問題。同時，針對一個具體問題，系統(tǒng)開展光子晶體編碼液相芯片的研制、應用和驗證工作，將有助于進一步加快研究進程，推動這一新技術的臨床轉化。

1 Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

2 Nolan JP,Sklar LA.Suspension array technology:evolution of the flat-array paradigm[J].Trends Biotechnol,2002,20(1):9-12.

3 Cunin F,Schmedake TA,Link JR,et al.Biomolecular screening with encoded porous-silicon photonic crystals[J].Nat Mater,2002,1(1):39-41.

4 Zhao XW,Cao Y,Ito F,et al.Colloidal crystal beads as supports for biomolecular screening[J].Angew Chem Int Edit,2006,45(41):6835-6838.

5 Zhao XW,Liu ZB,Yang H,et al.Uniformly colorized beads for multiplex immunoassay[J].Chem Mater,2006,18(9):2443-2449.

6 Wilson R,Cossins AR,Spiller DG.Encoded microcarriers for high-throughput multiplexed detection[J].Angew Chem Int Edit,2006,45(37):6104-6117.

7 Wang ZL,Lin J.Opal and inverse opal structure photonic crystal[J].Chin J Chem,2004,12:876-882.[王振領,林 君.蛋白石及反蛋白石結構光子晶體[J].化學通報,2004,12:876-882.]

8 Zhao YJ,Zhao XW,Pei XP,et al.Multiplex detection of tumor markers with photonic suspension array[J].Anal Chim Acta,2009,633(1):103-108.

9 Yang ZX,Chen BA,Wang H,et al.Handy,rapid and multiplex detection of tumor markers based on encoded silica-hydrogel hybrid beads array chip[J].Biosens Bioelectron,2013,48:153-157.

10 Yang ZX,Chen BA,Pei XP,et al.Multiplex analysis of tumor multidrug-resistance genes expression with photonic suspension array[J].Analyst,2012,137(14):3343-3348.

11 Pei XP,Chen BA,Li L,et al.Multiplex tumor marker detection with new chemiluminescent immunoassay based on silica colloidal crystal beads[J].Analyst,2010,135(1):177-181.

12 Lu WB,Fu C,Chen Y,et al.Multiplex detection of B-Type Natriuretic peptide,cardiac troponin I and C-reactive protein with photonic suspension array[J].PLoS One,2012,7(7).

13 Zhao YJ,Gu HC,Xie ZY,et al.Bioinspired Multifunctional Janus Particles for Droplet Manipulation[J].J Am Chem Soc,2013,135(1):54-57.

14 Zhao YJ,Zhao XW,Sun C,et al.Encoded silica colloidal crystal beads as supports for potential multiplex immunoassay[J].Anal Chem,2008,80(5):1598-1605.

15 Zhao XW,Zhao YJ,Gu ZZ.Advances of multiplex and high throughput biomolecular detection technologies based on encoding microparticles[J].Sci China Chem,2011,54(8):1185-1201.

16 Zhao YJ,Zhao XW,Hu J,et al.Multiplex Label-Free Detection of Biomolecules with an Imprinted Suspension Array[J].Angew Chem Int Edit,2009,48(40):7350-7352.

17 Zhao YJ,Zhao XW,Hu J,et al.Encoded Porous Beads for Label-Free Multiplex Detection of Tumor Markers[J].Adv Mater,2009,21(5):569-572.

18 Seal S,Thompson D,Renwick A,et al.Truncating mutations in the Fanconi anemia J gene BRIP1 are low-penetrance breast cancer susceptibility alleles[J].Nat Genet,2006,38(11):1239-1241.

19 Kmietowicz Z.Preventive surgery can cut risk of breast cancer by 90%[J].Brit Med J,2002,325(7367):735-735.

20 Zhao YJ,Zhao XW,Tang BC,et al.Rapid and Sensitive Biomolecular Screening with Encoded Macroporous Hydrogel Photonic Beads[J].Langmuir,2010,26(9):6111-6114.

21 Li J,Zhao XW,Zhao YJ,et al.Quantum-dot-coated encoded silica colloidal crystals beads for multiplex coding[J].Chem Commun,2009(17):2329-2331.