人LTF基因真核表達載體的構(gòu)建

單文姣　郝一　郭晨微　肖亮亮　洪艷　鐘韻

【摘 要】LTF基因表達產(chǎn)物乳鐵蛋白為一種多功能糖蛋白，其具有調(diào)節(jié)免疫，抗炎、抗微生物、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。LTF在鼻咽癌中表達下調(diào)，但其在鼻咽癌中的功能尚未完全明確。為探討LTF與鼻咽癌的關(guān)系，本研究以人cDNA為模板， PCR擴增LTF全長開放讀碼框，再將其定向插入真核表達載體， 測序鑒定序列和插入方向正確。LTF真核表達載體成功構(gòu)建，為進一步探索LTF基因在鼻咽癌細胞內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】真核表達載體；LTF；載體構(gòu)建

乳鐵蛋白（Lactoferrin， LTF） 是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，具有廣泛的生物學(xué)活性。它不僅參與體內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運及代謝、機體免疫調(diào)節(jié)，還具有抗炎癥、抗微生物及抗腫瘤等活性。

鼻咽癌的發(fā)生是多因素、多階段、多步驟的過程，遺傳因素是其發(fā)生的重要因素之一。研究顯示，LTF在慢性鼻咽炎中表達正常，在鼻咽癌中表達下調(diào)[1]，提示LTF可能是鼻咽癌候選抑瘤基因。本實驗構(gòu)建了LTF 基因真核表達載體為進一步進行LTF 基因體內(nèi)外功能研究奠定了基礎(chǔ)。

一、材料和方法

（一）菌株和載體

E.Coli DH5α菌株；pMD18-T載體 （Takara）是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（專用載體，有 Ampr 抗性；pcDNA3.1（-）載體（Invitrogen）含CMV啟動子，具有Ampr和Neor抗性，在真核細胞中高效表達。

（二）試劑

高保真聚合酶（LATaq， Takara）；HindIII、XbaI等內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase（Fermentas）；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒（Qiagen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）。

（三）方法

（1）引物設(shè)計和酶切位點分析

（1）LTF基因ORF引物設(shè)計 LTF mRNA序列（NM_002343.2），ORF擴增引物（目的片段2171bp），上游：5'-CGCCTCCAGACCGCAGACATGAAACTT-3'；下游：5'-CTGGGCCATCTTC TTCGGTT TTACTTC-3'。GAPDH引物（目的片段550 bp），上游：5'-CCACCCATGGCA AATTCCTCCATGGCA-3'；下游：5'-TCTAGACGGCA GG TCAGGTCCACC-3'。

（2）酶切位點分析 Webcutter 2.0分析LTF序列，結(jié)合pMD18-T和pcDNA3.1（-）載體特點，選用HindIII和XbaI作為多克隆位點。

（2） RT-PCR擴增LTF基因ORF

慢性鼻咽炎組織總RNA抽提，兩步法RT-PCR獲得cDNA。

（3）目的片段與克隆載體連接

（1）PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接：PCR純化產(chǎn)物 4μL，pMD18-T 1μL，緩沖液 5μL，補ddH2O至50 μL，16 ℃ 20 h。

（2）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定：①質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定。②質(zhì)粒抽提和鑒定：挑陽性克隆培養(yǎng)，試劑盒抽提。③鑒定：a. HindIII/XbaI雙酶切。b. 測序鑒定。

（4）LTF真核表達載體的構(gòu)建

（1）目的片段插入真核表達載體：取質(zhì)粒pMD18-T/LTF和pcDNA3.1（-），分別Hind III/Xba I雙酶切，回收目的片段，體外連接，體系如下：10×buffer 2μL，T4 DNA連接酶1μL，LTF目的片段 3μL，pcDNA3.1（-）線性片段1μL，加ddH2O至20μL，15 ℃ 18 h，65 ℃ 10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。

（2）陽性克隆鑒定：方法同前。

二、實驗結(jié)果

（一）以cDNA為模板擴增LTF基因ORF

RT-PCR方法從慢性鼻咽炎組織cDNA中克隆LTF基因ORF。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳顯示片段大小正確（約2.2kb）（圖1）。

圖1 RT-PCR擴增LTF ORF（0.8%瓊脂糖凝膠）

M：DL2000；Lane1-2：慢性鼻咽炎組織（GAPDH：550bp，LTF ORF：2171bp）。

（二）LTF基因ORF TA克隆載體的構(gòu)建

PCR擴增的LTF基因 ORF產(chǎn)物進行TA連接、轉(zhuǎn)化，挑Amp陽性克隆，PCR鑒定，第1-5號克隆可擴增出目的片段（圖2A）。挑第5號克隆抽質(zhì)粒，HindIII/XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳（圖2B）。測序鑒定顯示LTF基因ORF序列正確，并正向連接到pMD18-T載體。重組質(zhì)粒命名為pMD18-T/LTF。

圖2 LTF基因TA菌落克隆PCR和質(zhì)粒HindIII/XbaI雙酶切鑒定（0.8 %瓊脂糖凝膠）

M：DL2000；圖2A Lane1-5為5個TA克隆菌落PCR（LTF：207bp）；

圖2B中Lane1-3為陽性TA克隆HindIII/XbaI雙酶切（2.6kb/2.2kb）。

（三） LTF真核表達載體鑒定

HindIII/XbaI雙酶切pMD18-T/LTF載體，回收LTF序列并體外連接到pcDNA3.1（-）上，轉(zhuǎn)化、挑克隆，送菌液用T7通用引物測序（圖3）。測序結(jié)果blastn證明連接方向正確。構(gòu)建的LTF真核表達載體重命名為pcsLTF。

圖3.pcsLTF用T7通用引物測序

三、討論

LTF基因定位于3p21.3，其表達產(chǎn)物乳鐵蛋白分子量約為80kDa。LTF是非特異性免疫的重要組成部分，能對各種生理環(huán)境的變化做出應(yīng)答。LTF具有抗腫瘤作用，其表達下調(diào)或缺失是腫瘤發(fā)生的重要因素。

LTF抗腫瘤機制如下：①降低化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的癌變。動物實驗表明飲食添加乳鐵蛋白能抑制化學(xué)物致癌物誘導(dǎo)等腫瘤發(fā)生。LTF通過調(diào)節(jié)I和II相代謝酶活性，參與致癌物解毒過程，阻斷腫瘤發(fā)生。②調(diào)節(jié)腫瘤免疫作用。LTF能活化NK細胞；增強單核巨噬細胞的吞噬功能；刺激白介素、IFN-γ和TNF-α等細胞因子釋放；增強CD4、CD11、LFA-1、ICAM-1等細胞因子受體表達[2]。③抑制腫瘤血管生成：LTF可抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子 （VEGF）形成，誘導(dǎo)抗血管生成因子IL-18、INF-γ等[3]產(chǎn)生。④抑制腫瘤增殖。在乳腺上皮癌細胞中， LTF可通過P53非依賴性機制上調(diào)P21 蛋白表達；頭頸部腫瘤細胞中， LTF可通過Akt/ P27/ cyclinE/Rb 途徑及P19/ cyclinD1 發(fā)揮作用，從而誘導(dǎo)細胞周期阻滯。⑤誘導(dǎo)細胞凋亡。乳鐵蛋白肽體外通過調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞系和頭頸部癌細胞系中凋亡相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。綜上可見，LTF具有廣泛的抗腫瘤作用。

LTF 在鼻咽癌中作用及機制尚未明確。研究表明LTF的表達水平與鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。此外，LTF基因在鼻咽癌中可抑制EB感染，誘導(dǎo)細胞周期阻滯，抑制細胞增殖[4]。LTF在鼻咽癌中功能的研究，為鼻咽癌的發(fā)生機制及防治研究提示新方向。

參考文獻：

[1] Yi HM， Li H， Peng D，et al. Genetic and epigenetic alterations of LTF at 3p21. 3 in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncol Res. 2006；16（6）：261～272.

[2] Legrand D， Elass E， Carpentier M， et al. Lactoferrin： a modulator of immune and inflammatory responses[J].Cell Mol Life Sci. 2005， 62（22）：2549-2559.

[3] Kuhara T， Iigo M， Itoh T， et al. Orally administered lactoferrin exerts an antimetastatic effect and enhances production of IL-18 in the intestinal epithelium [J]. Nutr Cancer， 2000， 38（2）：192 -199.

[4] Deng M， Zhang W， Tang H， et al. Lactotransferrin acts as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma by repressing AKT through multiple mechanisms[J]. Oncogene. 2013， 32（36）：4273-4283.