氨肽酶及其抑制劑的構效關系

摘要：氨肽酶（APN/CD13；gp150）是一種鋅離子依賴型的外肽酶，廣泛分布于各種組織和細胞表面，并且在各種腫瘤細胞表面高表達，參與了腫瘤細胞的增殖，粘附，轉移，血管生成和腫瘤侵襲等過程。因此，氨肽酶被作為腫瘤治療中的重要靶點之一。目前，許多課題組通過計算機輔助藥物設計出了許多高效且選擇性高的化合物。本文通過介紹惡性腫瘤的轉移闡述氨肽酶的作用機制，并對氨肽酶的天然抑制劑和化合物抑制劑及其構效關系進行綜述。

關鍵詞：氨肽酶；氨肽酶 惡性腫瘤引起的死亡率僅次于腦血管疾病，位居世界第二。惡性腫瘤死亡率高居不下是由于其轉移和侵襲的生物特征。氨肽酶，又稱CD13抗體，是M1家族的一種多功能蛋白，本身具有催化活性中心，是細胞膜或組織表面的鋅離子依賴型的金屬蛋白酶。氨肽酶本身具有很強的輸水結構域，在很多組織及器官中廣泛分布，主要表達是在肝，腸，腎臟的單核細胞，上皮細胞中，尤其是在腫瘤細胞表面表達較高[1]，并且氨肽酶在腫瘤脈管系統中的內皮的表達明顯高于正常血管[2]，同時在不同腫瘤中APN的作用及其表達又有一定的差別[3]。APN分布廣泛，其生物學功能較為復雜，在不同的組織中呈現出不同的功能。氨肽酶在腫瘤細胞表面大量表達，可水解肽、酰胺等結構中的酰胺鍵，從而釋放出不同的N端中性氨基酸。同時，APN還可以調節與惡性腫瘤相關的肽，從而調節惡性腫瘤的轉移，分化，增殖，凋亡，以及血管生成等等[3]。

1 APN的催化機制

目前， APN的詳細作用機制尚不明確，但是有研究表明，APN的作用與mTOR/HIF-1α信號通路有關。Luke H. Stockwin等人，通過對缺氧條件下的黑色素瘤細胞質膜上的蛋白表達進行研究，確定了在低氧條件下，HIF-1α和APN的表達均提高[4]。Schmitt等人，在研究APN抑制劑的時候發現，當APN表達降低的時候，HIF-1α的表達量同時降低，進一步證實了這一觀點[5]。

雖然APN的詳細作用機制尚不明確，但是對其催化機制目前已經有了相當程度的認識。了解APN的催化機制對設計出更加有效更加合理的APN抑制劑是至關重要的。因此，已經有大量課題組研究了APN的底物及其過度狀態，以及活性位點，催化位點的3D結構，在此基礎上，發現了APN的催化位點有金屬離子（鋅離子）存在于其親水結構中，并且鋅離子在APN的催化過程中起到至關重要的作用。此外，APN活性中心附近的氨基酸的側鏈可以作為配基，利用氫鍵和周圍的殘基相連，這可能是為了降低連接中的熵值，使結合更加穩定。在催化過程中，鋅離子可能起到兩種作用[6]。

圖1 鋅離子在APN催化機制中的作用：穩定高活性的羥基（機制A），絡合氧原子促進水分子的親核攻擊（機制B）

首先：鋅離子可以固定高活性的羥基，從而確保在合適的PH條件下激活親核試劑的催化活性。其次，帶點的鋅離子可以作為親電催化劑絡合易斷開的肽鏈中的氧原子，從而促進水分子中親核部分的攻擊。也有學者猜測，APN活性位點的谷氨酸鹽作為親核試劑，起催化作用。或者酶有含雙核的金屬中心，羰基氧原子作為親核試劑協調其中一個或者兩個金屬與羥基的連接，但這兩種可能性與前面兩個相比較低。

2氨肽酶抑制劑

目前氨肽酶的抑制劑主要分為兩大類， 一種是從天然產物中發酵或直接提取獲得的，另一種是通過化學合成的方法得到有較高效價的化合物。

最早的APN天然抑制劑Bestatin是1976年由日本著名的抗生素研究者梅澤濱夫等人從橄欖網狀鏈球菌培養液中分離而得的[7]。但是由于Bestatin是在天然產物中提取的，手性中心不止一個，人工合成較難，限制了其大量應用。而且Bestatin至少可以抑制氨肽酶家族12 種不同的亞型[8]，選擇性抑制較差，而在腫瘤治療領域，需要有較大效能和一定選擇性的抑制劑。因此，開發出有高選擇性和強抑制作用的氨肽酶抑制劑具有重大意義。

近年來，隨著APN抑制劑的需求量增加，化學合成的APN抑制劑以其抑制活性高，選擇性強，生物利用度高，藥效時間長等優勢，逐漸被許多專家和學者重視。氨肽酶的小分子化合物抑制劑的研究得到了飛速的發展，其中涉及到的種類很多。但是這些化合物的效價及選擇性有待提高，且生物實驗數據有待明確，所以越來越多的氨肽酶抑制劑的設計及篩選都將重心轉到已知化合物的改進和修飾上來。

2.1新二氫吲哚-2，3-二酮衍生物 Kang Jin等人通過建立化學數據庫、對接虛擬篩選和進一步的活性分析，篩選出對氨肽酶抑制活性較強的化合物10c。以10c為先導化合物，設計一系列的二氫吲哚-2，3-二酮衍生物，作為APN 的抑制劑，初步顯示，圖2中X基團為氯原子的時候對氨肽酶有最優的抑制活性（IC50=0.074±0.0026μM）[9]。

圖2 化合物10c及其衍生物的結構

將X位點分別用氫，鹵素，甲基等取代，結果顯示，在該位點取代相關基團可以提高原化合物的活力，并且不同的鹵素在該位置取代時，對活力的影響也有所不同。氯取代的化合物活性強于溴取代的，氟取代的最弱。除了鹵素之外，甲基取代的化合物與未被取代的相比效能較高，但是仍然比Bestatin，和氯，溴的衍生物弱。同時，含異羥肟酸的側鏈必須有一定長度，延長側鏈會降低活性。另外，體外實驗顯示，含5～7個元素成環的縮酮的結構的化合物，在其吲哚骨架結構的3位上取代，得到的化合物有較強的活性。體外實驗該化合物對ES-2（人卵巢癌細胞，APN高表達）和MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）的抑制作用較陽性藥Bestatin更強。

2.2苯丙環庚酮類似物 Céline Schmitt等人設計了一系列的7-氨基-苯丙環庚酮衍生物（7-amino-benzocycloheptan-6-one derivatives）（圖3），作為新的氨肽酶選擇性抑制劑的前體結構[5]。從中選擇了三種具有不同Ki值的衍生物，建立相應的構效關系（SAR），從而確定了化合物的作用靶點為氨肽酶。同時，做了一系列的體外實驗如：酶活實驗，血管生成實驗室，細胞毒性實驗，管腔形成實驗等，評估了APN的生物學活性。

結果顯示，苯丙環庚酮類似物作為APN抑制劑，在毫摩爾到子納摩爾之間都具有高效抑制活性和高選擇性作用。體外實驗中，實驗組內皮細胞的形態和運動均被抑制，在基質膠上觀察到管腔形成明顯被抑制，且抑制作用強度與化合物濃度成正比。對于內皮細胞而言，抑制劑的抗腫瘤活性取決于細胞表面APN的表達。體內實驗中，給裸鼠靜脈注射最大耐受劑量的苯丙庚酮類似物，在29d內，注射化合物的裸鼠與陰性組相比未出現明顯變化，可以認定裸鼠可耐受化合物，表現為無毒性作用。

另外，有文獻報道以7-氨基-苯丙環庚酮衍生物作為骨架結構進行修飾，結果顯示五位取代外消旋的

圖3 新苯丙環庚酮衍生物結構

苯丙環庚酮也有較強的氨肽酶抑制作用。在實驗過程中，還意外的發現，五位硫代的化合物能更有效的對鋅離子活性位點的抑制效能[10]。一位溴代，四位修飾苯基的苯丙環庚酮類似物與Bestatin相比具有較高的效能，且合成步驟簡單，可大規模合成[11]。

2.3環狀酰亞胺衍生物 Shu-Xiang Cui等人[12]，針對氨肽酶的活性口袋中的有助于腫瘤增殖的部分，設計出結合活性口袋中S1和S'1位點的環酰亞胺類似肽（CIP-13F）（圖4），選用氨肽酶高表達的人卵巢癌細胞ES-2和氨肽酶低表達的HRA細胞系進行實驗。實驗結果顯示，CIP-13F可以有效的抑制ES-2細胞的增殖和遷移，同時，對HRA細胞沒有明顯的抑制作用，這說明合成的環酰亞胺類似肽具有較高的選擇性，這點被進一步用流式細胞實驗和Westen Blot實驗所證實。活體實驗中，對荷瘤鼠進行尾靜脈注射治療，可以發現與對照組相比，腫瘤大小有明顯的降低。

圖4 CIP-13F的結構

4氨肽酶的發展和展望

氨肽酶作為抑制腫瘤轉移的靶點，其抑制劑的研究已經取得了十足的進展，在此基礎上，對有效的氨肽酶抑制劑進行結構修飾，以求找到對氨肽酶抑制作用更強，選擇性更高，毒副作用更弱的化合物已經成為趨勢。結果顯示二氫吲哚-2，3-二酮衍生物，苯丙環庚酮類似物，亮氨酸脲基衍生物等均具有較強的ANP抑制劑作用和選擇性。但是這些化合物的生理學特性還沒有被闡明，進一步分析研究這些化合物對開發新型的抗腫瘤轉移，血管生成藥物具有重大意義。

參考文獻：

[1]Wickstrm M， Larsson R， Nygren P， et al. Aminopeptidase N （CD13） as a target for cancer Chemotherapy[J]. Cancer Sci，2011，102（3）：501-508.

[2]Pathuri G， Hedrick AF， Disch BC， et al. Synthesis and evaluation of novel Tc-99m labeled probestin conjugates for imaging APN/CD13 expression in vivo[J]. Bioconjug Chem，2012， 23（1）： 115-124.

[3]Malin Wickstro¨m， Rolf Larsson， Peter Nygren，et al. Aminopeptidase N （CD13） as a target for cancer chemotherapy[J]. Cancer Sci ， 2011（102）：501-508

[4]Luke H. Stockwin， Josip Blonder， Maja A. Bumke. Proteomic Analysis of Plasma Membrane from Hypoxia-Adapted Malignant Melanoma[J]，Journal of Proteome Research.2006（5）： 2996-3007

[5] Schmitt C， Voegelin M， Marin A， et al. Selective aminopeptidase-N （CD13） inhibitors with relevance to cancer chemotherapy[J]. Bioorg Med Chem. 2013 （7）：2135-2144

[6]Artur Mucha， Marcin Drag， John P. Dalton， Metallo-aminopeptidase inhibitors[J]. Biochimie.2010，（92）： 1509-1529

[7] Umezawa H， Aoyagi T， Suda H， et al. Bestatin， an inhibitor of aminopeptidase B， produced by actinomycetes[J]. Antibiot （Tokyo），1976，29（1）：97-99，

[8] Scornik OA， Botbol V. Bestatin as an experimental tool in mammals[J]. Curr Drug Metab. 2001，2（1）：67-85.

[9] Jin K， Zhang X， Ma C， et al. Novel indoline-2，3-dione derivatives as inhibitors of aminopeptidase N （APN）[J]. Bioorg Med Chem，2013，21（9）：2663-2670

[10] Albrecht S， Salomon E， Defoin A， et al. Rapid and efficient synthesis of a novel series of substituted aminobenzosuberone derivatives as potent， selective， non-peptidic neutral aminopeptidase inhibitors[J]. Bioorg Med Chem[J]， 2012，20（16），4942-4953.

[11] Mira Al-Lakkis-Wehbe， Lionel Roux， C edric Charrier， et al. Regioselective synthesis of the 1-bromo-4-phenyl-tetrahydro-7-aminobenzocyclohepten-6-one， a subnanomolar aminopeptidase-N/CD13 inhibitor[J]， Tetrahedron，2012，6447-6455.

[12] Cui SX， Qu XJ， Gao ZH， et al. Targeting aminopeptidase N （APN/CD13） with cyclic-imide peptidomimetics derivative CIP-13F inhibits the growth of human ovarian carcinoma cells[J]. Cancer Lett.，2010，292（2）：153-162.編輯/申磊抑制劑；構效關系