紫杉醇對三陰性乳腺癌JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

摘要：目的 研究紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞HCC1937的增殖抑制作用，探討ERK1/2及JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)機(jī)理。方法 ①采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度紫杉醇對HCC1937細(xì)胞增殖的抑制作用；②JNK特異性阻斷劑sp600125、MEK1/2ERK特異性阻斷劑U0126與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對HCC1937細(xì)胞增殖的抑制作用；③采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度紫杉醇給藥48h后HCC1937細(xì)胞周期的變化；④應(yīng)用Western Blot分別檢測不同濃度紫杉醇作用72h后P-ERK1/2、P-JNK/SAPK、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果 紫杉醇對HCC1937細(xì)胞的50%抑制率（IC50）為4-5μg/ml，細(xì)胞對紫杉醇不敏感；sp600125可以明顯抑制hcc1937細(xì)胞的生長，U0126對細(xì)胞的抑制不明顯，sp600125聯(lián)合紫杉醇對細(xì)胞的抑制作用大于sp600125、U0126和紫杉醇三藥聯(lián)合作用（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：紫杉醇；ERK1/2；JNK/SAPK；MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

近年來，隨著乳腺癌分子分型的細(xì)化，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）因其臨床組織分化差，術(shù)后易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，化療和放療近期有效率較高，但是治療后短期內(nèi)即出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而備受關(guān)注，已被列為單獨(dú)的臨床類型。目前尚沒有針對TNBC 的個(gè)體化的治療方案。紫杉醇是近年來治療乳腺癌較理想、且很有研究前途的一類新型化療藥物，已廣泛用于一線和二線局部晚期以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乳腺癌的治療，明顯改善了乳腺癌的治療效果[1-2]。然而它并非對所有患者均有效，據(jù)報(bào)道紫杉醇單用的一線治療有效率為32%～62%[3]。在三陰性乳腺癌方面，紫杉醇的效果尚無確切評價(jià)。因此，尋找紫杉醇劑量強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)，以指導(dǎo)個(gè)體化治療，改善患者的預(yù)后有重要意義。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞外各種信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。目前認(rèn)為，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[4]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已鑒定出四條MAPK通路。ERK1/2途徑主要介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；而另外三種途徑主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。MAPKs活化后調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，并在血管發(fā)生、腫瘤細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。研究證實(shí)，MAPK信號通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控[7-8]。為此，本文通過研究紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞HCC1937增殖抑制作用，探討ERK1/2及JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 HCC1937細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，紫杉醇注射液購自太極集團(tuán)四川太極制藥有限公司；RPMI 1640、FBS均購自GIBCO公司；CCK-8試劑盒購自凱基科技生物發(fā)展有限公司；兔抗β-actin、ECL發(fā)光試劑購自Millipore公司；兔抗P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK/SAPK、JNK/SAPK、U0126為Cell Signaling公司產(chǎn)品；sp600125購自cayman公司；Westernblot 儀器為美國Bio-Bad 公司制造。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HCC1937細(xì)胞給予含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（含1%的青霉素、鏈霉素），在37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)給藥。

1.2.1 CCK-8法測紫杉醇對HCC1937細(xì)胞毒性 將HCC1937細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后按照每孔5×104個(gè)接種到96孔板，培養(yǎng)24h后加入60 μg/ml、30 μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml、1.875μg/ml、0.9375μg/ml、0.46μg/ml、0μg/ml九個(gè)濃度的紫杉醇，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后測450nm的OD值。

1.2.2測出紫杉醇對Hcc1937細(xì)胞50%抑制濃度（IC50）后，將實(shí)驗(yàn)分為5組，分別以0ug/ml、sp600125（20UM）、U0126（10UM）、1μg/ml紫杉醇組、sp600125、U0126、1μg/ml紫杉醇三藥聯(lián)合作用5組細(xì)胞，阻斷劑提前處理細(xì)胞1h后加紫杉醇。

1.2.3 細(xì)胞周期的測定 取1×105細(xì)胞，先用70%冷乙醇固定30min，再用PBS洗2次，碘化丙啶常溫染色30min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

圖1紫杉醇對HCC1937細(xì)胞的抑制曲線

2.1紫杉醇-細(xì)胞抑制率曲線 隨紫杉醇濃度的增加，HCC1937細(xì)胞的抑制率曲線表現(xiàn)為先明顯下降，后出現(xiàn)一段平臺期，總體趨勢呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。IC50為4～5μg/ml（如圖1）。

圖2紫杉醇聯(lián)合sp600125對HCC1937細(xì)胞增殖抑制

cell lines sp600125（20uM）、U0126（10uM）提前處理細(xì)胞1h后加紫杉醇作用細(xì)胞48h后測藥物對細(xì)胞毒性*表示sp600125聯(lián)合紫杉醇和兩種阻斷劑聯(lián)合紫杉醇較紫杉醇組細(xì)胞存活率降低（P<0.05）。sp600125聯(lián)合紫杉醇對細(xì)胞的抑制作用大于sp600125、U0126、紫杉醇三藥的聯(lián)合作用。

2.2流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化 在紫杉醇對HCC1937細(xì)胞抑制率曲線平臺期，不同濃度紫杉醇作用HCC1937細(xì)胞72h后，隨濃度的增加（A→E），細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，并呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（如圖3）。

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化

2.3紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞HCC1937 MAPK信號通路蛋白的影響 紫杉醇作用人乳腺癌細(xì)胞HCC1937抑制率曲線平臺期，隨紫杉醇濃度增加， HCC1937人乳腺癌細(xì)胞P-ERK蛋白表達(dá)較對照組降低，各濃度組之間蛋白表達(dá)沒有差異性，而P-JNK/ SAPK蛋白表達(dá)較對照組有所增強(qiáng)，其中1.875 ug/ml 的紫杉醇對P-JNK/ SAPK蛋白表達(dá)明顯高于其他濃度組，其他組P - JNK /SAPK蛋白表達(dá)沒有明顯差異。

圖4 紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞HCC1937 MAPK信號通路蛋白的影響

注：A、B、C、D、E分別代表用紫杉醇濃度為0、0.9375μg/ml、1.875 ug/ml、7.5 ug/ml、15ug/ml。

3 討論

三陰性乳腺癌（ triple negative breast cancer） 是指雌激素受體（ estrogen receptor ER） 、孕激素受體（progesterone receptor， PR）和人表皮生長因子受體2（ human epidermal growth factor receptor2， HER2）均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌的15%。體外研究顯示BRCA1相關(guān)性乳腺癌對雙功能烷化劑（ bifunctional alkylatingagent） 、絲裂霉素C （mitomycin2C） 、鉑類和依托泊（ etoposide） 、博來霉素等藥物極其敏感，但對紫杉烷類、長春新堿類藥物耐藥。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以抑制人乳腺癌細(xì)胞HCC-1937增殖，但其抑制作用較ER陽性的Mcf-7細(xì)胞顯著降低。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞喪失分化和凋亡的能力，引起細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，形成腫瘤。激活的MAPK表達(dá)水平增高已在人的多種腫瘤中檢測到。因此，MAPK通路的不正常激活是許多腫瘤的一個(gè)基本特征，深入研究這個(gè)通路將為腫瘤的治療開辟新的途徑。

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