纖維素酶協同機械法制備微/納纖絲

摘 要：以楊木紙漿纖維為原料，采用纖維素酶水解法協同機械處理法制備出微/納纖絲（Micro/Nanofibrils）。酶處理制備微/納纖絲的影響因素按大小依次為：時間、加酶量、料液比。最佳工藝條件：處理時間為36 h，加酶量30 FPU，料液比為1∶40。酶解后纖維的結晶度為84.2%，纖維素含量為95.26%，再經過纖絲進行超聲和高壓均質間歇式處理來制備微/納纖絲。從SEM圖可以看出，纖絲表面起毛、分絲帚化，次生壁中層S2上微纖絲暴露，分離出了細小纖維。纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經達到納米級纖絲要求。

關鍵詞：纖維素酶；微/納纖絲；機械處理

中圖分類號：TQ340.1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.11.002

21世紀以來，隨著資源的嚴重匱乏和人們對環保的日益重視，可再生生物質資源的利用具有了重要意義[1]。纖維素是地球上極為豐富的可再生生物質資源之一，占地球總生物量的40%[2-3]，廣泛應用于造紙、塑料、炸藥、電工及科研等方面。從天然纖維中分離出的微/納纖絲具有高強度、高結晶度、高純度、生物可降解、親水性強等特性，因此，微/納纖絲在高性能復合材料中顯示出廣闊應用前景。微/納纖絲（micro/nanofibrils）包括微纖絲（microfibril）和納米纖絲（nanofibril）兩種。微纖絲被定義為直徑在0.1～1 μm，長度在5～50 μm的纖維，納米材料則包括至少一維空間的尺寸為納米級（1～100 nm）[4]。

微/納纖絲的制備方法有化學法、機械法、生物法、人工合成法、靜電紡織法、酶處理法等[5]。相比較來說，酶處理法制備微/納纖絲具有反應條件溫和、能耗低、設備要求相對簡單、經濟環保等優勢[6]，且所用的試劑酶與纖維素酶均為可再生資源[7]，因此，酶處理工藝更適合今后的大量生產微/納纖絲。

本研究以楊木紙漿纖維為原料，通過纖維素酶協同機械法處理，致力于以環境友好方式制備出微/納纖絲，運用高效液相色譜、X射線衍射儀和掃描電子顯微鏡對制備出的微/納纖絲進行表征分析，研究其細化后的性能變化。

1 材料和方法

1.1 材 料

楊木紙漿纖維：購置于江蘇某造紙廠，纖維素含量為77.44%，半纖維素含量為15.72%，酸不溶木素為5.1%，結晶度為68.2%。纖維素酶：購置于寧夏和氏璧公司，是由青霉菌發酵液精制而成，濾紙酶活為48.86 FPU·g-1。主要試劑：檸檬酸、過氧化鈉、亞硫酸鈉、硫酸、3，5-二硝基水楊酸、偏重亞硫酸鈉等分析純均購于南京化學試劑有限公司。

主要儀器：高效液相色譜（美國安捷倫公司），高壓均質儀（定制于日本某研究公司），超聲波細胞粉碎機（南京先歐儀器制造有限公司），馬爾文激光粒度儀（馬爾文公司），X射線衍射儀（島津/KRATOS公司），JSM-7600F場發射掃描電鏡（日本電子）等。

1.2 酶解楊木紙漿纖維中纖維素/半纖維素的測定[8]

稱取（300.0±10.0） mg已用酶處理過的楊木紙漿纖維置于干燥皿中，加入（3.00±0.01） mL72%硫酸，充分潤濕混勻。將干燥皿置于（30±3） ℃水浴中振蕩反應（60±5） min，振蕩須保證所有納米纖維素浸潤于硫酸溶液中，完全水解。水解完成后，從水浴槽中取出干燥皿，加入（84±0.04） g純水，將硫酸濃度稀釋至4%。將樣品置于高壓滅菌器中，溫度設置為121 ℃，時間60 min。反應結束后，冷卻至室溫。用已準備好的磨成粉狀的脫水Ba（OH）2，中和樣品pH值至5～6。離心后，取上清液作高效液相分析用，從圖譜中計算出葡萄糖、木糖濃度。從而可以計算出樣品中纖維素和半纖維素的絕干百分比。公式（1）如下：

纖維素/半纖維素含量=×100%（1）

式中，C為水解后單糖的濃度，單位為g·L-1；MC為楊木紙漿纖維的含水率，0.087為水解液的總體積，單位為L；0.3為酸水解原料的質量，單位為g；0.9為纖維素和半纖維素水解葡萄糖對應的系數。

用蒸餾水洗滌殘渣，后將殘渣在105 ℃下干燥至恒質量并稱質量，將其作為酸不溶木質素的質量；取一定量的水解上清液用分光光度法在205 nm處測定其吸光度AOD，然后按式（2）計算相應的酸溶木素。

酸溶木素=×8.7%（2）

1.3 楊木紙漿纖維預處理

（1）楊木紙漿纖維的粉碎。由于纖維過于粗，用植物粉碎機對楊木紙漿纖維再加工，過0.18 mm篩。

（2）化學處理[9]。由于楊木紙漿纖維中仍然有少量半纖維素、木素及其它雜質，這會影響微/納纖絲的制備，因此要將其去除。選擇固液比為1∶30，在NaSO3濃度為3%，蒸煮時間為2 h，溫度為200 ℃，脫去楊木紙漿纖維中的木質素，水洗至中性，收集濾渣；選擇固液比為1∶30，NaOH濃度為8%，堿處理時間3 h，溫度80 ℃，脫去楊木紙漿纖維中的半纖維素，水洗至中性，收集濾渣；選擇固液比為1∶40，H2O2濃度5%，處理時間1 h，溫度45 ℃，脫去果膠等雜質，水洗至中性，收集濾渣。經高效液相得出圖譜，通過公式（1）和（2）分別計算得出纖維素含量為92.85%、半纖維素含量為1.87%、木質素含量為0.88%，適合作為酶解纖維素的底物。

1.4 正交試驗

為了考察最優條件，選擇加酶量、酶解時間和料液比作為考察因素，運用3因素3水平作正交試驗，確定微/納纖絲的最佳工藝參數，具體因素水平如表1所示。

1.5 纖維素酶解楊木紙漿纖維

將堿預處理后的纖維素與緩沖溶液以一定的料液比加入纖維素酶液，在適宜的溫度以及pH值下酶解反應一定時間，達到纖維素酶的平衡聚合度，滅酶5 min，過濾，濾渣風干，粉碎，即得楊木紙漿微/納纖絲。

1.6 機械法處理楊木紙漿纖維

由于纖維素酶選擇性地酶解掉無定形的纖維素而剩下部分纖維素晶體[10]，因此，可以用機械法加以輔助酶解微/納纖絲，以較為環保的方式獲得結晶度較高、粒徑較小的產物。本試驗中采用超聲波粉碎儀和高壓均質儀間歇式處理已酶解過的微/納纖絲以獲得質量更優的微/納纖絲。

1.7 X射線衍射分析（XRD）[11]

樣品按照X射線衍射儀的測試要求裝片。X光為銅靶，掃描步長為0.05°，掃描范圍為5°～40°，5°·min-1。測試條件為電壓40 kV，電流30 mA，采用2θ/θ步進掃描。根據Turley法計算試樣的結晶度[11]，計算公式為：

CrI=×100% （3）

式中，CrI為結晶度指數；I002為（002）晶格衍射角的極大強度；Iam為代表2θ角近于18°時非結晶背景衍射的散射強度。I002與Iam單位相同。

1.8 JSM-7600F場發射掃描電子顯微鏡（SEM）分析

配制已制備好的微/納纖絲溶液，放入冷凍干燥箱中冷凍干燥48 h后取出并立即存放入干燥器中以備檢測微/納纖絲的長度、粒徑、形態等[12-14]。臨界點干燥，噴金，放入JSM-7600F場發射掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察。

2 結果與分析

2.1 正交試驗分析

本試驗采用的纖維素酶由青霉菌發酵液精制而成，此種酶經試驗在50 ℃下酶解效率最好，因此本試驗酶解溫度定為50 ℃[15-21]。采用3因素3水平的正交試驗，確定制備微/納纖絲的最佳工藝參數，得到CrI較高的微/納纖絲。根據公式（3）和XRD圖譜算出每組試驗的CrI，正交試驗結果見表2。

由表2可知，酶處理制備楊木紙漿微/納纖絲的影響因素依次為A>C>B，即時間、加酶量、料液比。最佳工藝條件為A2B2C1，即最佳工藝條件為加酶量30 FPU，處理時間為36 h，料液比為1∶40。由于酶中含有蛋白質等雜質，使原料中纖維素含量有所降低，可以通過適當的堿處理來去除蛋白質，再進行機械處理以制備粒徑更小的微/納纖絲。

通過馬爾文激光粒度儀Zetasizer Nano對酶解后微/納纖絲的粒徑分布進行測量。從圖1可以看出，溶液中去除蛋白前后的變化情況。

圖1（a）中有2個峰值，在80 ℃下進行熱堿處理后得到圖1（b），圖1（b）有一個峰值，這說明，酶處理后的產物中蛋白質已經去除。因此，可以得出：圖1（a）中粒徑分布范圍在100～1 000 nm，光強小的峰值是試驗材料中酶的粒徑范圍分布情況。從（a）、（b）兩圖中均可看出，酶處理后的產物粒徑分布范圍大都在1 m以上，說明酶處理后的微/納纖絲大部分還是聚集形態的纖絲束，還需要進一步的機械法處理才能獲得粒徑分布范圍更小的納米纖絲。圖1（b）中1 m以上纖絲粒徑分布較圖1（a）變窄，這是由于纖維在熱堿溶液中能夠發生剝皮反應（150 ℃下發生），引起纖維素降解。

按照正交試驗的結果進行驗證試驗，由計算可知纖維素酶水解后楊木紙漿纖維的CrI為84.2%，這表明纖維素酶水解作用破壞了纖維素的非結晶區，使酶解后的纖維CrI提高。去除蛋白后纖維素的含量為95.26%。纖維素酶水解后，纖維素的結晶度和含量均有所改善。

2.2 機械法再處理

盡管在本試驗的最佳酶解條件下獲得纖絲的纖維素含量和結晶度提高較大，但是酶解的作用趨于緩和，在粒徑的提高方面明顯不夠。用機械法加以輔助酶解，不僅較之化學法污染更小，而且可以獲得更小粒徑的微/納纖絲[21]。

本試驗采用超聲波粉碎儀和高壓均質儀間歇處理酶解后的微/納纖絲。配制濃度為0.05%的酶解后的楊木紙漿纖維溶液100 mL（已達到微米級別，見圖2中（a）、（b）和（c）），選用1/2″探頭（探入式）、振幅為80 μm、處理時間90 min（分3次）、脈沖時間6 s、脈沖間隔4 s。打開高壓均質儀的壓力閥，調整壓力至1 000～1 500 bar，分3組進行均質，每組5次，每次處理時長約為2 min。超聲波處理和高壓均質處理為間歇式，即：超聲波處理→高壓均質處理→超聲波處理→高壓均質處理→超聲波處理→高壓均質處理。

2.3 楊木紙漿微/納纖絲的表征分析

采用JSM-7600F場發射掃描電子顯微鏡（SEM），分別對酶解后和超聲波/高壓均質儀處理后的楊木紙漿纖維的形態進行研究，配制濃度為0.05%微/納纖絲溶液進行冷凍干燥，48 h后放入掃描電鏡下觀察，結果如圖2所示。

圖2中的（a）、（b）和（c）圖為酶處理后楊木紙漿纖維的SEM圖。從圖中可以看出，纖維比較疏松多孔，這說明酶處理已經使纖維的初生壁和次生壁外層脫落。但是團聚現象較嚴重，分散不均勻，粒徑分布大都在10 m左右，如圖（c）所示。因此，還需機械力輔助使纖維產生縱向分裂，破壞纖絲與纖絲之間的氫鍵作用以獲得分散均勻、粒徑達到納米級的納米纖絲。

圖2中的（d）、（e）和（f）圖為酶處理協同機械法處理楊木紙漿纖維的SEM圖。從圖中可以看出，經過超聲波和高壓均質間歇處理后的纖維已經分離成纖絲狀。纖維素鏈上的主要功能基是羥基（—OH），羥基不僅對纖維素的超分子結構有決定作用，而且也影響其化學和物理性能。—OH基之間或—OH基與O—、N—和S—基團能夠聯接，即氫鍵。因此，只有纖絲與纖絲間的氫鍵斷裂，才能獲得微/納纖絲。酶處理協同機械法處理纖維正是運用于此，才制備出了如圖2中（d）～（f）納米級的纖絲。如圖2中（d）、（e）和（f）所示，纖絲具有較大的比表面積，并且長徑比大，圖2（f）表明：纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經達到納米級纖絲要求。從圖2（d）、（e）和（f）中還可以看出，纖絲表面起毛、分絲帚化，這是因為次生壁中層S2上微纖絲暴露，分離出了細小纖維。

3 結 論

（1）酶處理制備楊木紙漿微/納纖絲的影響因素按大小依次為：時間、加酶量、料液比，最佳工藝條件為：加酶量30 FPU，處理時間為36 h，料液比為1∶40。

（2）熱堿處理去除酶解產物中的蛋白質，纖絲的CrI為84.2%，纖維素含量為95.26%。纖絲的CrI和含量均有所改善。

（3）采用超聲波粉碎儀和高壓均質儀間歇處理酶解后的微/納纖絲，獲得產物達到納米級別，從電鏡圖中可看出，次生壁中層S2上微纖絲暴露，纖絲表面起毛、分絲帚化，分離出了細小纖維。纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經達到納米級纖絲要求。

參考文獻：

[1] Lavoine N， Desloges I， Dufresne A， et al. Microfibrillated cellulose-Its barrier properties and applications in cellulosic materials： A review[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 90（2）： 735-764.

[2] Okahisa Y， Abe K， Nogi M， et al. Effects of delignification in the production of plant-based cellulose nanofibers for optically transparent nanocomposites[J]. Composites Science and Technology， 2011， 71（10）： 1 342-1 347.

[3] 張越，聶李麗，宋建，等.木質纖維素酶為原料的燃料乙醇預處理技術研究進展[J].天津農業科學，2011，17（4）：113-116.

[4] 程慶正，王思群.天然木質微/納纖絲增強納米復合材料的研究現狀[J].林產工業，2007，34（3）：3-7.

[5] 李珊珊，張洋.酶處理制備木質材料微/納纖絲的研究進展[J].木材加工機械，2013（1）：43-47.

[6] 張鶴，佟心潔，龐春生，等.纖維素酶酶解玉米秸稈新型蒸煮漿的工藝研究[J].現代食品加工，2012，28（2）：182-186.

[7] 蘇勇.酶處理和化學法對麥秸微納纖絲制備工藝及特性影響[D].南京：南京林業大學，2012：6-8.

[8] Ogren K， Bura R， Saddler J， et al. Effect of hemicellulose and lingin emoval on enzymatic hydrolysis of stem pretreated corn stover[J]. Bioresource Technology， 2007， 98：2 503-2 510.

[9] 范國榮，朱新傳，盧平英，等.杉木微晶纖維素制備工藝的研究[J].江西林業科技，2005（3）：3-4.

[10] 劉嬌，宋公明，馬麗娟，等.不同預處理方法對玉米秸稈水解糖化效果的影響[J].飼料工業，2008，29（1）：31-32.

[11] 李堅.木材波譜學[M].北京：科學出版社，2003：181-185.

[12] 劉一星，趙廣杰.木材資源材料學[M].北京：中國林業出版社，2007：104-111.

[13] Samir M， Alloin F. Review of recent research into cellulosic whiskers， their properties and their application in nanocomposite field[J]. Biomacromolecules， 2005， 6（2）： 612-626.

[14] 張彩莉，張鑫.微晶纖維素的特性及應用[J].中國調味品，2006，9（9）：46-48.

[15] 劉德龍，張玉蒼，何連芳，等.稻草液化產物纖維素的酶解糖化研究[J].中國釀造，2011（2）：55-58.

[16] 宋曉磊，姚春麗.納米微晶纖維素的制備及在造紙中的應用研究[J].造紙科學與技術，2011，30（3）：43-47.

[17] 李偉，王銳.納米纖維素的制備[J].化學進展，2010，22（10）：2 060-2 070.

[18] Ogeda T L， Silva I B， Fidale L C， et al. Effect of cellulose physical characteristics， especially the water sorption value， on the efficiency of its hydrolysis catalyzed by free or immobilized cellulase[J]. Journal of biotechnology， 2012， 157（1）： 246-252.

[19] 張麗君，李愛軍，歐仕益.酶解法制備大豆皮微晶纖維素的研究[J].廣東農業科學，2012（14）：113-116.

[20] 劉艷萍，張洋，江華，等.木聚糖酶處理對麥秸表面性能的影響[J].福建農林大學學報：自然科學版，2009，38（5）：548-551.

[21] 丁桂峰，潘浪勝，高文姬.纖維素酶預處理花生殼工藝條件優化[J].應用化工，2012，41（6）：996-999.