ADSCs復(fù)合HA促進(jìn)裸鼠背部軟組織血管化的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討ADSCs復(fù)合HA促進(jìn)裸鼠背部軟組織血管化的實(shí)驗(yàn)研究 方法：根據(jù)所選材料不同，將實(shí)驗(yàn)分為三組，A組為ADSCs復(fù)合HA，B組為ADSCs復(fù)合脂肪顆粒，C組為單純ADSCs，分別將3組試劑隨機(jī)注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3個(gè)點(diǎn)，3個(gè)月后獲取相應(yīng)標(biāo)本，觀察相應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果：①大體觀察：A組組織塊吸收最少，B組組織塊吸收較少，C組組織塊基本吸收最多；②濕重測(cè)定：A組明顯高于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）；③存活率比較（%）：A組明顯高于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.01），B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；④微血管密度（MVD）：A組明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B組高于略高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；結(jié)論：HA作為生物支架復(fù)合ADSCs可加速裸鼠軟組織血管化的形成，為整形美容外科脂肪干細(xì)胞移植中生物支架的選擇提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]透明質(zhì)酸；脂肪干細(xì)胞；生物支架；血管化；整形美容外科

[中圖分類(lèi)號(hào)]R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）10-1076-03

自體脂肪移植是理想的修復(fù)軟組織缺損的方法，但移植的脂肪組織成活率低，限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用[1-2]。脂肪干細(xì)胞生物支架復(fù)合物是指在脂肪干細(xì)胞移植過(guò)程中加入相應(yīng)生物支架，可用來(lái)促進(jìn)移植部位的血管化作用，來(lái)提高游離組織的存活率。本研究主要探討透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）作為生物支架與脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adipose tissues derived stem cells，ADSCs）混合后對(duì)裸鼠背部軟組織血管化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器：II型膠原酶、DMEM培養(yǎng)液、血清、pbs液、胰蛋白酶、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織勻漿機(jī)、純水系統(tǒng)、恒溫CO2培養(yǎng)箱、低溫臺(tái)式離心機(jī)、精密天平、恒溫?fù)u床、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)瓶、離心管、脂肪抽吸針等吸脂手術(shù)器械。支架材料：透明質(zhì)酸鈉（Sigma，美國(guó)）；脂肪組織來(lái)源于臨床吸脂病人抽取組織。抽取為雙下肢股外側(cè)及股后側(cè)脂肪，患者對(duì)本實(shí)驗(yàn)知情并自愿捐獻(xiàn)自體脂肪組織100ml用于本研究。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸鼠10只，3W，平均體質(zhì)量15g，雄性，由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

1.2.1 干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：膠原酶消化脂肪，分離收集原代ADSCs置DMEM培養(yǎng)液傳代，收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞。ADSCs按4×105有核細(xì)胞/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，常用的75mm塑料培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞3×107左右，加入低糖DMEM+10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞，DII熒光標(biāo)記。

1.2.2 干細(xì)胞一生物支架復(fù)合物制備、植入和取材： 根據(jù)所選材料不同，將實(shí)驗(yàn)分為3組，A組將ADSCs按1：1比例與HA混合，B組將ADSCs按1：1比例與脂肪顆?；旌希珻組為單純ADSCs，分別將3組試劑按0.2ml（0.2cm3）隨機(jī)注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3個(gè)點(diǎn)，3個(gè)月后獲取相應(yīng)標(biāo)本，并行免疫組化染色。

1.2.3 觀察：①大體觀察：肉眼觀察各組織塊間體積的大??；②濕重：沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，立即以電子天平稱(chēng)濕重；③存活率：存活率=術(shù)后復(fù)合組織塊濕重/術(shù)前復(fù)合組織塊濕重；④微血管密度（MVD）：各實(shí)驗(yàn)組根據(jù)CD31免疫組化染色結(jié)果，免疫組化染色圖片其陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域一般為黃色或棕黃色，因此采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，每組選取6張（×200）不同視野的免疫組織化學(xué)染色圖片比較各組微血管生成情況，并根據(jù)圖像分析軟件測(cè)量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用 SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用LSDt檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1大體觀察：各實(shí)驗(yàn)組體積變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，不同實(shí)驗(yàn)組變化出現(xiàn)較大的波動(dòng)，A組組織塊吸收最少，B組吸收較少，C組組織塊吸收最多。術(shù)后A、B、C、D四組組織塊體積分別為0.172cm3、0.147cm3、0.109cm3：A組組織塊明顯大于B、C組。

2.2 濕重測(cè)定：A、B、C分別為：（0.076±0.006）g、（0.052±0.007）g、（0.021±0.002）g，A組明顯高于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 存活率比較（%）：A、B、C組成活率分別為：（86.00±4.10）%、（73.50±5.17）%、（62.00±4.16）%。A組明顯高于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 微血管密度（IOD）：A、B、C組分別為88.19±11.21、56.23±10.08、21.22±10.72，D組為：65.24±7.71，見(jiàn)圖1A、B、C。A組明顯高于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、表2。

3 討論

自2001年[3]發(fā)現(xiàn)ADSCs以來(lái)，科研人員使用不同的誘導(dǎo)因子將其誘導(dǎo)分化為不同的組織細(xì)胞。Zuk等[3]最早發(fā)現(xiàn)它可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化。隨后的研究表明ADSCs不僅可以分化為中胚層的細(xì)胞系，還可以分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞以及內(nèi)胚層的血管內(nèi)皮細(xì)胞等。ASCs取材容易、來(lái)源豐富，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marow derived stromal/stem cells， BMSCs）一樣具有自我更新能力、活力持久及多向分化潛能等干細(xì)胞特征，并且具有穩(wěn)定生長(zhǎng)和增殖、促進(jìn)組織修復(fù)的能力，促進(jìn)移植物的血管化，提高存活率。ASCs在已經(jīng)在整形外科領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用較多，如自體脂肪移植、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等，因此，關(guān)于ASCs的研究成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]，其已成為組織工程中較常用的理想的種子細(xì)胞[5]。

非動(dòng)物源性的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種天然的高分子多糖，是世界上公認(rèn)的保濕劑，HA很容易發(fā)生降解，透明質(zhì)酸具有非抗原性，很少引起炎癥和異物反應(yīng)因其無(wú)致敏性、容易獲得且本身就是細(xì)胞基質(zhì)成分，作為組織工程支架具有廣闊的前景[3]。之前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸鈉可作為生物支架并與脂肪干細(xì)胞混合，并具有一定的協(xié)同作用[7]。

故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織工程技術(shù)，將透明質(zhì)酸鈉做為支架材料，與 ADSCs混合成復(fù)合物，探討其在小鼠軟組織中促進(jìn)其血管化的研究，筆者發(fā)現(xiàn)，與無(wú)支架的單純脂肪干細(xì)胞或與以脂肪顆粒為支架的復(fù)合物相比，脂肪干細(xì)胞-透明質(zhì)酸鈉復(fù)合物在裸鼠軟組織中血管化作用比較明顯，其血管數(shù)量較多、結(jié)構(gòu)較典型，為脂肪干細(xì)胞-透明質(zhì)酸鈉復(fù)合物可加速小鼠軟組織血管化的形成及其血管化程度提供客觀數(shù)據(jù)，從而證明透明質(zhì)酸鈉作為組織工程中生物支架的可行性，為臨床脂肪干細(xì)胞移植中生物支架的選擇提供理論依據(jù)，并為整形美容外科提供一種新的修復(fù)材料。

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[收稿日期]2013-03-23 [修回日期]2013-05-02

編輯/張惠娟