[摘要] 目的 探討漢黃芩素在人膠質瘤患者中對U251細胞的增殖與凋亡及對存活素（Survivin）及半胱天冬酶-3（Caspase-3）表達的影響。 方法 不同濃度漢黃芩素作用于人膠質瘤96株U251細胞，并與使用替莫唑胺（TMZ）的陽性對照組（48株）及未給予任何藥物的空白對照組（48株）對比細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及Survivin和Caspase-3蛋白的表達強度。 結果 各濃度漢黃芩素對細胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組，且隨藥物濃度及作用時間的增加呈現出顯著增高趨勢（P < 0.05），漢黃芩素組細胞凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01），TMZ組顯著高于空白對照組（P < 0.01），在漢黃芩素組內，細胞凋亡率隨著藥物濃度增加顯著增加（P < 0.05）；漢黃芩素組Survivin表達強度顯著低于TMZ及空白對照組（P < 0.01）；兩藥物組Caspase-3表達強度顯著高于空白對照組（P < 0.01）。 結論 漢黃芩素可通過調節Survivin、Caspase-3蛋白的表達對膠質瘤U251細胞起到誘導凋亡的作用。

[關鍵詞] 漢黃芩素；膠質瘤；U251；增殖；凋亡；Survivin；Caspase-3

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0005-03

膠質瘤是最為常見的顱內原發性腫瘤，據統計，膠質瘤占腦腫瘤總數的50%～55%。該腫瘤呈浸潤性生長，手術難度較大，生物學特性復雜，放化療不敏感，療效差，預后差[1]。近年來，隨著對膠質瘤研究的深入，特別是對中藥或中藥提取活性單成分的研究均表明其具有多種抗腫瘤活性，且副作用少。漢黃芩素是傳統中藥黃芩及半枝蓮的活性提取物，其抗腫瘤活性近年來受到廣泛關注[2]。筆者使用漢黃芩素溶液處理人膠質瘤細胞U251，以探討其對U251細胞增殖與凋亡及對Survivin及Caspase-3表達的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

中科院上海細胞庫提供的人膠質瘤U251細胞192株，Gibco BRL公司提供的RPMI1640培養基、新生牛血清（FBS）、胰酶-EDTA混合液、PBS緩沖液（1×），北京索萊寶科技有限公司提供的青鏈霉素混合液（100×），Abcam公司提供的β-actin小鼠單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供的Survivin兔多克隆抗體、CCK8試劑盒，Millipore公司提供的PVDF膜，美國Pierce公司提供的BCA蛋白測定試劑盒，漢黃芩素由中國食品藥品檢定研究院提供（批號：111514-200403），替莫唑胺膠囊（TMZ）由江蘇天士力帝益藥業有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 人膠質瘤U251細胞復蘇并接種于含10%新生胎牛血清和含1%鏈霉素、青霉素的RPMI 1640（1∶10混合）完全培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下進行傳代培養孵育，以0.25%胰蛋白酶消化，待細胞貼壁覆蓋80%～90%時進行實驗。漢黃芩素及TMZ用DMSO溶解為100 mmol/L的母液，儲存于4℃恒溫箱內，使用前進行稀釋。U251細胞株分組：漢黃芩素組96株，TMZ組48株，空白對照組48株。

1.2.2 細胞增殖抑制率、凋亡率、Survivin以及Caspase-3表達情況檢測 CCK8法測定計算細胞增殖抑制率，流式細胞術測定細胞凋亡率，Western blot測定Survivin及Caspase-3蛋白的表達情況。

1.3 統計學方法

使用SPSS 13.0統計學軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，均數比較采用方差分析及t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率比較

漢黃芩素各濃度對細胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組，且抑制率隨著藥物濃度及作用時間的增加呈現出顯著增高趨勢[t12.5μmol/L=2.769 6（24～48 h），2.544 1（48～72 h），P12.5μmol/L=0.008 1（24～48 h），0.014 4（48～72h）；t25μmol/L=2.161 1（24～48 h），2.128 2（48～72 h），P25μmol/L=0.035 9（24～48 h），0.038 7（48～72 h）；t50μmol/L=2.068 7（24～48 h），2.071 1（48～72 h），P50μmol/L=0.031 7（24～48 h），0.044 0（48～72 h）；t100μmol/L=8.196 3（24～48 h），4.673 6（48～72 h），P100μmol/L=0.000 0（24～48 h），0.000 0（48～72 h）]。100 μmol/L漢黃芩素組的細胞增殖抑制率與TMZ組大致相當，僅48h具有顯著差異（t = 2.1834，P < 0.05）；漢黃芩素組同一時間內抑制率隨著藥物濃度的增加而呈現出顯著增高趨勢[t24h=7.635 5（12.5～25 μmol/L），6.3687（25～50） μmol/L，6.664 9（50～100） μmol/L，P24h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L；t48h=6.682 8（12.5～25） μmol/L，3.753 4（25～50） μmol/L，6.855 5（50～100） μmol/L，P48h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.0005（25～50） μmol/L，0.0000（50～100） μmol/L；t72h=7.389 5（12.5～25） μmol/L，5.034（25～50） μmol/L，10.592 8（50～100） μmol/L，P72h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L]。

2.2 細胞凋亡率比較

漢黃芩素組及TMZ組細胞凋亡率均顯著高于空白對照組（P < 0.01）；同濃度的漢黃芩素造成的凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01）；在漢黃芩素組內，細胞凋亡率隨著藥物濃度增加而呈現出顯著差異（P < 0.05）。

2.3 藥物作用48 h Survivin表達情況比較

兩組藥物處理組Survivin蛋白表達強度均顯著低于空白對照組（P < 0.01），且漢黃芩素組顯著低于TMZ組（t =8.365 0，P = 0.000 0）。

2.4 藥物作用48 h Caspase-3表達情況比較

漢黃芩素組及TMZ組Caspase-3蛋白表達強度均顯著高于空白對照組（P < 0.01）；TMZ組與漢黃芩素組Caspase-3蛋白表達強度比較差異無統計學意義（t = 0.864 7，P =0.388 6）。

3 討論

腦膠質瘤是最為常見的顱內惡性腫瘤，其治療一直是醫學界的難題。膠質瘤因其生物學特性及病理生理特點均較為復雜，且呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織界限不明確，從而對該病的手術切除造成極大困難，本病對放射治療敏感性較低，療效較差，而化療雖然能夠起到一定作用，可有效殺滅腫瘤細胞，但同時對機體正常細胞的毒性作用也較為明顯，權衡利弊，獲益較少[3]。該病惡性程度較高，進展迅速，預后不良，且具有較高的復發率和死亡率，因此，新型藥物的研發迫在眉睫。人膠質瘤U251細胞株與人實質性腫瘤性質相似，是研究膠質瘤的常用細胞株。通常細胞凋亡或細胞程序性死亡是一個正常的生理過程，可以消除不必要的細胞，維護組織的動態平衡。如果能夠對細胞增殖與凋亡之間的平衡進行調節，則可對腫瘤的生長進行有效干預，因此可通過誘導細胞凋亡及程序性死亡等途徑對癌癥進行治療[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的一員，但又與凋亡蛋白家族其他成員有所不同，是被克隆出來的一種凋亡抑制蛋白，能夠抑制細胞凋亡，且具有腫瘤特異性，在正常組織中不表達，僅在胚胎發育組織及多數人類腫瘤組織中有不同程度表達，與多種癌細胞的分化增殖及浸潤轉移均具有密切相關。且Survivin在癌癥患者體內的過度表達將導致不良預后，同時還與放化療耐藥性密切相關[5]。Caspase是存在于角質溶膠中的結構相關半胱氨酸蛋白酶，屬于一種促凋亡因子，Caspase-3在細胞凋亡過程中起著不可替代的作用[6，7]。生理條件下Caspase-3以無活性的Caspase-3酶原形式存在，僅在細胞凋亡早期被上游蛋白酶切割方可被激活，激活后即可對胞漿胞核底物進行裂解，最終導致細胞凋亡[8]。

漢黃芩素是傳統中藥黃芩的活性提取物，其中抗腫瘤活性近年來引起了廣泛關注。目前關于該物質抗膠質瘤的機制并不清楚，學術界對此也未達成共識。但多家研究已證實，漢黃芩素具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[9，10]。而關于漢黃芩素作用于Survivin及Caspase-3從而抑制膠質瘤細胞生長、促進膠質瘤細胞凋亡的研究卻鮮有報道。筆者采用不同濃度漢黃芩素作用于人膠質瘤U251細胞，發現漢黃芩素抑制U251細胞增殖呈濃度及作用時間依賴性；而且應用流式細胞儀檢測發現漢黃芩素作用于U251 48 h后，細胞出現凋亡。為了進一步研究漢黃芩素抗膠質瘤作用的分子機制，本實驗先后采用Western blot及半定量RT-PCR檢測細胞中Survivin及Caspase-3的表達。結果顯示，漢黃芩素可下調Survivin、上調Caspase-3的表達，上述作用與TMZ相當甚至更具優勢。Survivin抗細胞凋亡作用的機制可能是[11]：①通過結合細胞周期調節因子CDK4，形成Survivin/CDK4復合物，釋放p21，進而使CDK4與Procaspase-3相互作用達到抑制細胞凋亡的作用；②通過桿狀病毒的IAP重復序列分子中的Trp67、Pro33、Cys84等氨基酸殘基與Caspase-3結合從而抑制Caspase-3活性，進而抑制由Caspase-3導致的細胞凋亡。本次研究結果顯示，漢黃芩素能夠下調Survivin、上調Caspase-3的表達，因此即可通過上述兩種可能的機制降低Survivin對細胞凋亡的抑制作用，而增強Caspase-3導致的細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞的凋亡。

綜上所述，漢黃芩素具有誘導膠質瘤U251細胞凋亡的作用，同時可通過作用于Survivin、Caspase-3等蛋白的表達對U251細胞凋亡或增殖起到一定調節作用。

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（收稿日期：2013-03-06）