微囊化成骨細胞誘導骨髓間充質干細胞體外成骨分化的量效研究

[摘要] 目的 探討微囊化成骨細胞體系細胞添加量對誘導骨髓間充質干細胞體外成骨分化的影響。 方法 制備含有成骨細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊，與間充質干細胞的共培養，在1，7，14 d通過細胞增殖量、堿性磷酸酶活性、實時定量PCR等檢測，統計結果并分析。 結果 各時段細胞增量無統計學意義；堿性磷酸酶活性隨細胞濃度增加表現出遞增趨勢，且骨鈣蛋白mRNA的表達結果基本一致。 結論 微囊化成骨細胞在低濃度下已能促進骨髓間充質干細胞成骨分化，濃度升高時促分化能力越強，但達到一定濃度后繼續提高時，對成骨分化的作用則不再增強。

[關鍵詞] 微囊；成骨細胞；骨髓基質干細胞；分化

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0004-01

骨缺損和骨折不愈合是骨科醫生常面臨的困難，骨組織工程為解決這一問題帶來了希望。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）作為骨組織工程的種子細胞已獲得了廣泛的認同[1]。骨髓間充質干細胞是一種具有多方向分化潛能的干細胞[2]，目前的研究表明BMSCs能夠分化為成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等，不表達共刺激抗原，是一種理想的種子細胞，可以修復受損的人體組織，在組織工程和整形外科等領域具有重要的研究價值[3]。由于人體組織器官結構功能的復雜性，干細胞在植入人體前應進行體外誘導分化，從而降低臨床應用的危險性[4]。基于上述前提，我們設計了以下的實驗研究。

1 材料與方法

1.1成骨細胞分離培養和鑒定

新生SD大鼠處死后，在無菌條件下，取顱蓋骨，去除軟組織，將骨塊剪成1～2 mm2大小后PBS溶液反復洗滌，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入5 mL胰蛋白酶溶液（濃度為0.25%），37℃ 15 min水浴振蕩消化后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入3 mL Ⅱ型膠原酶溶液（濃度1 mg/mL），在37℃水浴消化90 min，離心后除去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液后，用吸管輕輕打散細胞沉淀，制成細胞懸液，接種于25 cm2培養瓶內于37°C，5%體積分數CO2環境中培養。48 h全量換液繼續培養，每3天換1次液，待細胞融合到80%時，吸去培養基，用PBS沖洗2次后用1 mL含有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，加入培養液終止消化，離心加培養液重懸之后，采用差速貼壁法篩選獲取純化的成骨細胞原代。待細胞集落呈70%～80%匯合時開始傳代，傳代3次后進行堿性磷酸酶染色鑒定。

1.2 骨髓間充質干細胞的分離、培養以及免疫表型、成骨分化潛能的鑒定

采用全骨髓貼壁法分離BMSCs：SD大鼠麻醉后常規消毒，備皮，左側股骨大轉子處作骨髓穿刺術。抽取3 mL左右骨髓置于離心管，PBS沖洗，離心（1000轉/10 min）后棄上清和脂肪，洗滌2次后加入含有標準培養基的培養瓶中，37°C，5%體積分數CO2環境中培養。48 h后換液，以PBS洗滌2次，換上新鮮培養基，繼續培養。每3天換液一次，待到細胞集落呈70%～80%匯合時，開始傳代。

BMSCs的成骨分化潛能的鑒定：取第3代BMSCs接種于放有細胞爬片的6孔培養板，細胞覆蓋達80%，棄去普通培養液，加入含成骨細胞誘導劑的培養液，每3天換液一次，培養2周。成骨細胞誘導劑含β-甘油磷酸鈉10 mM，地塞米松10-9 M，抗壞血酸鈉0.2 mM，FBS。經成骨誘導培養2周后取出細胞爬片進行堿性磷酸酶染色鑒定。

1.3 微囊化成骨細胞（OB-APA微囊）的制備和培養以及形態學觀察

1.3.1 微囊化成骨細胞的制備和培養 靜電液滴發生法制備OB-APA微囊：將成骨細胞與15 g/L的海藻酸鈉溶液以體積比1∶10混合均勻，吸入20 mL注射器，在最優制備條件下混入0.1 mol/L CaCl2，海藻酸鈣微球，靜置10 min后除去上清液，生理鹽水洗滌3次，將膠珠投入0.5%聚左賴氨酸震蕩條件下反應5 min，生理鹽水洗滌3次，再用1.5 g/L的海藻酸鈉溶液振蕩5 min，除去上清液并用生理鹽水洗滌3次，再投入55 mmol/L檸檬酸鈉液化5 min，生理鹽水洗滌，即得OB-APA微囊[5]。

1.3.2 微囊化成骨細胞計數 采用機械破囊計數法測定制備的OB-APA微囊中的成骨細胞的量，即采用1 mL無菌注射器，內徑約為330 nm 的3號針頭反復抽吸微囊懸液，使微囊破碎。顯微鏡下觀察以確定細胞已完全釋放，然后采用200目篩網過濾微囊碎片，離心，重懸細胞，使用細胞計數板計數。

1.3.3 微囊化成骨細胞形態學觀察及形態學觀察 制得的微囊化成骨細胞置于培養皿內，使其分散均勻，倒置顯微鏡下觀察其形態。

1.4 實驗分組及設計

將第3代BMSCs 接種于放有爬片的培養皿中，細胞密度為5×106 cells/cm2的密度，加入微囊化成骨細胞，及10%胎牛血清的DMEM培養液。根據成骨細胞與骨髓基質干細胞的添加量的比值進行分組。A組：15∶1；B組：10∶1；C組：5∶1；D組：1∶1。

1.5 共培養后BMSCs向成骨細胞定向分化的生物學檢測

1.5.1 通過測定DNA含量變化分析BMSCs增殖情況 培養的1、7和14 d，每組取出3個樣本，PBS液沖洗后0℃下在含有EDTA和巰基乙醇的細胞裂解液中消化30 min。得上清液，超聲儀高頻聲波裂解，4℃離心（12 000轉/5 min）。取40 μL的細胞裂解上清液與160 μL的Hoechst 33258染液混合（1 μg/mL）通過稀釋1 mg/mL的牛胸腺DNA獲得標準曲線，對比標準曲線測得DNA的含量，并通過熒光計測量每個樣品的熒光強度。

1.5.2 堿性磷酸酶活力檢測 在共培養的第1、7和14天，每組取出3個樣本，PBS液沖洗后，0℃下在含有EDTA和巰基乙醇的細胞裂解液中消化30 min。離心，得上清液，超聲儀高頻聲波裂解，4℃離心（12 000轉/5 min）。取100 μL上清液并與400 μL的P-硝基苯磷酸混合，37℃下孵育15 min后50 μL NaOH終止反應。紫外分光光度計在450 nm波長下測定吸光度。

1.5.3 實時定量PCR 骨鈣蛋白是檢測成骨細胞成熟分化的標志物。各實驗組分別在培養第1、7和14天進行RT-PCR檢測。引物序列如下。

1.6 統計學分析采用IBM SPSS17.0軟件，對各組數據進行t檢驗及方差分析。P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞和骨髓基質干細胞的生長情況及ALP染色倒置顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形和紡錘形；OB呈卵圓形，培養瓶中可見典型的鋪路石樣。倒置顯微鏡下可見骨髓基質干細胞成骨分化能力良好。

2.2 OB-APA的形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察到微囊完整性好，不粘連，表面光滑，微球粒徑分布也較為均勻。

2.3 BMSCs的增殖情況檢測

各試驗組在各個時間點的細胞增殖量基本相同，差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.4 BMSCs的分化情況檢測

2.4.1 ALP活性檢測結果 在兩種細胞共培養的第1天，各實驗組的堿性磷酸酶基本沒有區別（P > 0.05）；在共培養第7天和第14天，A組與B組細胞的堿性磷酸酶活性較C組與D組高（P < 0.01，P < 0.05），C組的堿性磷酸酶活性較D組高（P < 0.05），且在第7天和第14天，A組與B組的堿性磷酸酶活性無統計學意義（P > 0.05）。

2.4.2 RT-PCR檢測Osteocalcin（OCN） mRNA的表達 骨鈣蛋白是成骨細胞的表型之一，且被認為是成骨細胞成熟分化的重要標志。在兩種細胞共培養的第1天，各實驗組的OCN mRNA的表達情況沒有統計學意義（P > 0.05）；在共培養7 d后，A組與B組細胞的OCN mRNA的表達情況較C組與D組高（P < 0.05），C組的OCN mRNA的表達情況較D組高，但差異無統計學意義（P > 0.05），且在第7天和第14天，A組與B組的堿性磷酸酶活性無統計學意義（P > 0.05）。

3 討論

骨髓基質干細胞具有多向分化能力，取材廣泛，能在各自特定的條件下分化為成骨細胞[6]，具有典型干細胞的特點[7-8]。BMSC不僅具有較強的增殖能力，而且隨機體衰老，其仍能保持良好的干細胞特征。體外傳代12代以上仍能保持正常的染色體組型和端粒酶活性，也就是在體外傳代過程中可以維持其干細胞特性[9]。

成骨細胞具有分泌作用，可分泌骨形態發生蛋白[10]，堿性成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子[11]、胰島素樣生長因子[12]等。研究表明，骨形態發生蛋白在體外培養下可以促進BMSCs成骨分化[13-14]，且BMP具有跨種誘導成骨的能力[15]。血小板衍生因子是刺激骨髓基質干細胞有絲分裂和遷移最重要的因素[16-17]。

微囊技術[5]，即以海藻酸鈉和聚賴氨酸為材料，制備APA微囊，將分泌生長因子的細胞包裹在微囊內，與目的細胞共培養，當微囊在細胞分泌生長因子的條件下，使靶細胞定向分化。微球囊的成骨細胞和骨髓間充質干細胞共培養后，在微球囊的成骨細胞分泌的多種生長因子作用下，骨髓間充質干細胞于體外定向分化為成骨細胞，共培養后微球囊包裹的成骨細胞可以完全去除，達到非接觸共培養的目的。已有研究表明微囊化成骨細胞具有促進骨髓基質干細胞分化為成骨細胞的能力[18]，但是微囊化成骨細胞與骨髓基質干細胞的量效關系尚未見報道。

本實驗首先探討了微囊化成骨細胞與骨髓基質干細胞共培養時不同添加比例對BMSCs成骨分化的影響影響。實驗發現，微囊化成骨細胞的添加濃度對骨髓基質干細胞的增殖沒有明顯統計學意義；添加的微囊化成骨細胞在1∶1濃度下已能促進骨髓基質干細胞成骨分化，且隨著添加濃度的升高，促進骨髓基質干細胞分化的能力越強，但是在濃度達到10∶1之后提高濃度對促進骨髓基質干細胞分化的作用沒有增強，并且證實10∶1的微囊化成骨細胞對骨髓基質干細胞的增殖達到最大的量效。

本研究的骨髓基質干細胞基于靜態培養基誘導培養，而體內骨髓基質干細胞處于相對動態環境。在上述研究的基礎上有必要進一步的深入研究，全面比較體外共培養時力學刺激因素能否促進骨髓基質干細胞的成熟分化，且加入力學刺激因素后需求的微囊化成骨細胞的量效關系。

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（收稿日期：2013-03-15）