姜黃素增強宮頸癌放療療效的實驗研究

【中圖分類號】R97 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0188-01

【摘要】目的 觀察姜黃素對宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用。方法 MTT法檢測姜黃素和放射線對Hela細胞的抑制作用，繪制細胞抑制率曲線，研究姜黃素與放射聯合應用時的作用特點；流式細胞法檢測細胞周期和凋亡。結果 姜黃素對Hela細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈時間和濃度依賴性；單純照射對宮頸癌增殖有平臺效應， 聯用姜黃素則可進一步增強對宮頸癌的殺傷效應；單獨照射和姜黃素均能使細胞周期阻滯于放射敏感時相G2/M期，誘導細胞凋亡，聯合作用效果更加顯著。結論 姜黃素可通過阻滯細胞周期于G2/M期對宮頸癌Hela細胞產生放療增敏作用。

放射治療是宮頸癌的重要治療手段，對宮頸癌的照射不可避免的會對宮頸周圍膀胱、直腸等器官造成輻射損傷 [1]。故而，采用同步放化療綜合治療模式，即通過同步應用小劑量化療藥物在不增加甚至降低射線劑量的基礎上達到增強放射線對腫瘤細胞的殺傷作用已被廣泛應用于臨床多種腫瘤的治療[2]。

姜黃素具有多種藥理活性。有研究表明姜黃素對胰腺癌[3]、腎癌[4]、前列腺癌[5]具有放療增敏作用，但對宮頸癌放療作用報道較少，本文通對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela細胞株（湖北醫藥學院臨床研究所）；姜黃素（HPLC>98%，成都思科華生物技術有限公司）；Clinac 600C/D加速器（ 美國Varian 公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coluter公司）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 宮頸癌Hela細胞培養于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常規培養，每2-3d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2照射方法 在室溫下采用6MV-X線照射，照射野10×10cm，劑量率40 cGy/min，源皮距為100cm，分別一次性給予各實驗組6、8、10、12、14、16Gy劑量。

1.2.3放射線對Hela細胞增殖的影響 取對數生長期Hela細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，參照文獻按輻射劑量分為6、8、10、12、14、16Gy共6組，每組設5個復孔，給予一次性射線照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），繼續孵育4h，棄各孔液體，每孔加入150μL二甲基砜，低速震蕩10min，酶標儀檢測各孔在562nm波長處吸光度值，計算抑制率，求出輻射劑量坪值，即細胞增殖抑制率達最高的射線劑量。細胞抑制率=（1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值） ×100%。

1.2.4MTT法測定姜黃素的輻射敏感性 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，分為空白組、單藥組、單放組、藥放組。空白組只加細胞與培養液；單放組劑量取上述實驗的坪值；單藥組姜黃素終濃度參照文獻確定為50，25，12.5，6.25，3.125μmol/L共5組，藥放組輻射劑量和藥物濃度分別同單放組劑量和單藥組濃度，共5組，每組設5個平行樣本，測定各組吸光值后通過公式計算細胞抑制率。

1.2.5細胞周期分析及凋亡檢測 細胞分組及處理同1.2.4，取處理完畢的4組細胞各1×106個， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定過夜，清除固定液，加入PBS100μl混勻細胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混勻，置37℃水浴鍋中加溫30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常溫避光30min后，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件分析，擬合計算出細胞各時相百分比和凋亡率。

1.3統計學分析 所得數據以均數±標準差（x±s）的形式表示，SPSS17.0軟件模擬生存曲線并進行單因素方差分析（兩兩比較采用S-N-K法），以P<0.05為差別有統計學意義，以P<0.01為差別有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 Hela細胞對射線照射的敏感性 射線照射對宮頸癌細胞增殖可產生明顯的抑制作用，在射線劑量12Gy以內時，隨著射線劑量的加大和照射后作用時間的延長，對細胞增殖的抑制率也明顯增加，呈現出一定的量效和時效關系。在12Gy處出現坪值，故選用12Gy加藥物進行后續的增敏實驗。

2.2姜黃素對Hela細胞增殖的影響 經不同濃度姜黃素作用24、48、72h后，Hela細胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈時間，濃度依賴性。各濃度姜黃素作用48h，細胞增殖抑制率在7%-81%之間，與對照組比較，12.5μmol/L姜黃素即可產生有統計學差異的抑制作用（P<0.05），而25μmol/L及以上濃度的姜黃素抑制作用則更強（P<0.01）。

2.3姜黃素對Hela細胞的放射增敏作用 選取12Gy劑量射線加不同濃度姜黃素作用于Hela細胞結果顯示出細胞增殖抑制率可進一步隨藥物濃度的增加而升高，當濃度大于25μmol/L時曲線趨于平坦。藥物加輻射后，其24h細胞增殖抑制率均較單純輻射或單純藥物組有統計學差異（P<0.05）。

2.4細胞周期分析及凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡結果表明，與空白組比較，單純放射或藥物均能提高G2/M期細胞比例，誘導細胞出現凋亡（P<0.05），而放射與藥物聯合則作用效果更為顯著（P<0.01）。

3討論

姜黃素具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗血管新生以及抗腫瘤等多種生物學功能。本研究中，筆者觀察了姜黃素同步放療對宮頸癌Hela細胞增殖的影響，結果發現，單純應用姜黃素，細胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應用放射線照射，細胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當輻射劑量達到12Gy時細胞增殖抑制率達到坪臺期，不再隨射線劑量的加大而增加。在此基礎上，選用12Gy放射線聯合不同濃度的姜黃素做進一步的觀察，結果顯示，在單純輻射劑量已達到“閾值”的情況下，聯用姜黃素可使細胞增殖抑制效果得到進一步的提高，且對細胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組（P<0.05），說明同步應用姜黃素確實可對宮頸癌細胞放療產生增效的作用，但這種增效作用只是控制在一定濃度的范圍之內。

為初步探明增效機制，筆者進一步檢測了姜黃素同步放療后對宮頸癌細胞凋亡和細胞周期的影響，結果發現，單獨藥物、單獨射線均能對細胞產生誘導凋亡和G2/M期阻滯的作用，而聯合應用后作用效果更為顯著，這說明姜黃素的放療增敏作用與其能阻滯細胞周期于對放療敏感時相G2/M期有關。△湖北省十堰市科技局基金資助項目（ZD2012026） 湖北醫藥學院第三臨床學院資助項目（201201）

參考文獻

[1]金健，張國楠，樊英.同步放化療治療中晚期宮頸癌50例臨床療效觀察[J].實用婦產科雜志，2007，23（5）：287-289.

[2]徐鳳華，郭榮榮，孫華燕.吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌的系統評價[J].中國循證醫學雜志，2009，9（2）：218-229.

[3]Veeraraghavan J，Natarajan M，Lagisetty P，etl.Impact of curcumin， raspberry extract， and neem leaf extract on rel protein-regulated celldeath/radiosensitizationin pancreatic cancer cells[J].Pancreas.2011，40（7）：1107-1119.

[4]李剛，王子明，種鐵.姜黃素對人腎癌ACHN細胞放射的增敏作用及其機制[J].西安交通大學學報（醫學版），2011，32（3）：299-302.

[5]LiM，Zhang Z，Hill DL，etl.Curcumin，a dietary component，has anticancer， chemosensitization，and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mTOR/ETS2 pathway[J].Cancer Res.2007，67（5）：1988-1996.