利福平和異煙肼抗結核分支桿菌耐藥基因的研究

【中圖分類號】R378.9 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0186-01

【摘要】耐藥結核病是全世界結核病疫情第三次回升的重要原因，結核病耐多藥菌株的出現(xiàn)增加了結核病治療的難度，目前，用于結核病治療的一線要主要是利福平和異煙肼。異煙肼耐藥機制非常復雜，與之耐藥相關的基因較多，如：katG，inhA，aphC，kasA，ndh等。其中最主要的耐藥基因為katG 、inhA 基因。利福平相關耐藥基因研究較為明確，目前認為rpoB基因的突變是MDR-MTB菌株的標志。迄今為止，對利福平和異煙肼抗結核分支桿菌耐藥性的檢測方法有多種，實際工作中需要將多種檢測方法同時運用，以使檢測結果真實可信，及時為臨床治療提供有效的依據(jù)。

【關鍵詞】耐藥結核病；利福平，異煙肼；耐藥基因；檢測方法

肺結核是世界上主要的公共衛(wèi)生問題，是嚴重危害人類身體健康的傳染性疾病之一。二十世紀五、六十年代人們便期望找到一種有效的方法來控制肺結核的傳染，最后達到治愈結核病的目的，但目前肺結核仍是一個全球性的流行病，成為全球性的公共衛(wèi)生問題，每年大概有2-3百萬的人死于這種疾病。近年來，肺結核在艾滋病患者中的廣泛傳播再一次引起了公眾的關注1，耐藥結核桿菌尤其是耐多藥結核桿菌的出現(xiàn)和傳播是導致結核病發(fā)病率升高的重要原因。本文就結核桿菌對利福平和異煙肼產(chǎn)生耐藥性的相關基因，以及耐藥性檢測的方法做一綜述2。

1 異煙肼

異煙肼（isoniazid，INH），是抗結核病的常用一線藥物，在結核病的治療中一直起著重要的作用。但大多數(shù)結核病患者如果長期用藥易產(chǎn)生耐藥性，這主要是由于長期使用INH可誘導細菌產(chǎn)生基因突變，從而使細菌對INH的耐藥性增強。有研究表明 。

1.1 katG 基因是過氧化氫酶‐過氧化物酶的編碼基因，katG基因全長2223個核苷酸，上游與相隔44個堿基的furA基因（一種結核桿菌鐵調控蛋白編碼基因，可能為katG基因的啟動子，并調控其表達）相連，下游與相隔2794個堿基的embC基因相連。katG 基因最常見的點突變位點是第315位氨基酸和第463 位氨基酸。其常見的點突變是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突變通常會造成過氧化氫一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐藥。在C. Yao1， T. Zhu2， Y. Li1， L. Zhang1， B. Zhang1， J. Huang1 and W. Fu 的研究中選取了41個樣本，其中32個分離株的突變是AGC→ACC，9個分離株的突變是AGC→AAC。此外還有研究發(fā)現(xiàn)katG基因104、108、138、148位等突變。因而katG基因序列改變的具體位點與katG酶的活性的改變還有待進一步的研究。

1.2 inhA 基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依賴的enoyl‐ACP 還原酶的編碼基因。當活化的INH（異煙堿酰基）與inhA酶（enoyl-ACP還原酶）活性部位的輔因子NAD結合后，生成高親和力的共價化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP還原酶的親和力，進而干擾了脂酸的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。inhA 基因突變約占異煙肼臨床耐藥株的8% ～ 20% ，耐藥的發(fā)生可由于inhA結構基因突變造成INH與NADH的親和力下降，或是inhA啟動子-15的C→T的點突變，引起對INH耐藥。與katG基因突變相比較，inhA基因的突變伴隨低水平INH耐藥性，InhA的突變不僅引起INH耐藥，還會引起結構相近的二線抗結核藥物乙硫異煙（ETH）的耐藥性，而katG突變后耐藥水平的高低取決于基因突變對過氧化氫—過氧化物酶活性的影響，突變導致酶活性完全喪失可引起高度INH耐藥。

1.3 kasA 基因，ahpC基因和ndh基因

kasA 基因編碼β‐酮酰基載體蛋白合成酶，與分枝菌酸生物合成相關，是異煙肼耐藥的另一個相關基因，最常見的突變是第312位點。ahpC 基因是烯酰基還原酶的編碼基因，參與氧化-應激應答的表達，它能控制解毒酶基因的如katG 基因的表達。Dhandayuthapani[9]等發(fā)現(xiàn)部分katG突變的耐異煙肼分離株存在ahpC啟動子（存在于oxyR-ahpC區(qū)）突變，增強ahpC表達來補償過氧化氫酶一過氧化物酶的缺乏，從而抵抗宿主巨噬細胞的氧化。ndh 基因能編碼NADH 脫氫酶，ndh 基因的突變使NADH 脫氫酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制異煙肼的過氧化，也阻止異煙酰乙酸NADH 與inhA 酶的結合，從而使結核桿菌產(chǎn)生耐藥性。katG、inhA、kasA 、ahpC和ndh基因突變并不能解釋所有的異煙肼耐藥問題，相關的機制還有待進一步研究。

隨著異煙肼耐藥相關基因和耐藥機制的深入研究，其敏感性必定會得到較大提高。

2 利福平

利福平是抗結核病多藥聯(lián)合方案中的主要成分之一，其主要作用對象是結核分枝桿菌DNA 依賴的RNA 聚合酶的β 亞基，通過抑制mRNA 的轉錄，發(fā)揮抗菌作用，與之相關的耐藥基因主要是其編碼基因rpoB。rpoB基因是結核桿菌DNA依賴RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，全長3543個堿基，95%左右的RFP耐藥菌株的基因突變都集中在rpoB基因507～533位的27個氨基酸（81bp）組成的區(qū)域，這一突變區(qū)被稱為利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）。當RRDR發(fā)生突變時，包括點突變或短的插入、缺失突變等，使DNA依賴性RNA聚合酶B亞單位酶結構改變，利福平不能與細菌RNA聚合酶β亞單位結合而表現(xiàn)為耐藥。已知RFP耐藥菌的rpoB基因有14種突變，其中9種突變對利福布丁和利福噴丁交叉耐藥。531、526位點突變株對所有利福霉素類藥物均高度耐藥。到目前為止，利福平相關耐藥基因研究已較明確，其中以編碼531位氨基酸的堿基TCG→TTG的和編碼526位氨基酸的堿基CAC→TAC的突變最常見，因此這個區(qū)域的突變可作為一種檢測結核桿菌耐RFP簡易、快速的方法。在臨床分離的MDR-MTB中，86%的耐藥株有rpoB基因的突變，因此認為rpoB基因的突變是MDR-MTB菌株的標志。

3耐藥性的檢測方法

迄今為止，對利福平和異煙肼抗結核分支桿菌耐藥性的檢測方法有多種。變色液體培養(yǎng)基法3利用選擇性培養(yǎng)基顏色的改變以檢測結核分枝桿菌的耐藥性。MTT檢測法4 5也被用于結核分枝桿菌耐藥性的檢測，MTT是黃色四唑鹽燃料能在有代謝活性的細胞內被脫氫酶降解產(chǎn)生紫色的甲月替，進而通過分光光度計（570nm）檢測吸收光的變化。SYBR Green I-based real-time定量PCR檢測法6也被用于結核分枝桿菌耐藥性的檢測。隨著分子生物學的進一步發(fā)展，The GenoType MTBDRplus assay7是目前在結核分枝桿菌耐藥性的檢測中應用最為廣泛的一種方法，與傳統(tǒng)的檢測方法相比較，該方法更能快速的檢測出耐藥的突變基因，但Jin8 等的研究表明，雖然The GenoType MTBDRplus assay具有較強的優(yōu)越性，但在其研究中發(fā)現(xiàn)一個較罕見的katG S315N突變卻不在這一檢測方法內。

隨著結核分支桿菌耐藥性的不斷增強以及新型耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，目前如果只單純的運用某一方法來進行檢測是不能得到準確可信的結果，因而我們要將多種檢測方法同時運用，以使檢測結果真實可信為結核分枝桿菌耐藥的檢測提供優(yōu)效的證據(jù)。

4 展望

結核病耐多藥菌株的出現(xiàn)增加了結核病治療的難度，而耐藥機制是治療的關鍵，隨著分子生物學技術的發(fā)展，耐藥機制的研究得到了有效的提高。結核病耐多藥菌株主要是由于基因的突變引起，及時對患者的突變菌株進行檢測為臨床的治療將提供有效的治療依據(jù)，從而減輕患者的病情，為進一步治療和控制耐多藥結核病提供了有效的手段。

參考文獻

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