凱氏定氮法消化實驗方法的改進

摘 要：在實驗教學過程中，測粗蛋白質（CP）的傳統方法是先消化粗蛋白質，在消化粗蛋白質時，耗費時間極長，容易引起燒干消化管，而使實驗失敗。本人經過多年教學實踐提出新的技術改進方法，這種新的實驗方法大大縮短了消化時間，通過實驗結果比較，本方法實驗效果好，時間快，實驗成功率高。

關鍵詞：實驗教學；粗蛋白質；消化管

1 實驗材料與試劑

1.1主要儀器

分析天平（0.0001g），KDN-20消化爐，半微量凱氏蒸餾裝置。

1.2 試劑與材料

AR硫酸（密度為1.84g/ml），混合催化劑（CuSO4·5H2O， 無水硫酸納），過氧化氫（30%），氫氧化鈉（40%），鹽酸，四硼酸鈉，硼酸（2%），甲基紅，溴甲酚綠，95%乙醇，消化管，玻璃珠，小漏斗，50ml酸式滴定管，100ml容量瓶，20ml大肚移液管，250ml三角瓶。樣品為市售豬肉，火腿腸，蛋糕，面包，桃酥。

2 實驗分組

將粗蛋白質消化實驗方法分成四組：第一組，按凱氏定氮法的常規消化實驗進行消化。第二組，加樣品與試劑同第一組，再加入AR過氧化氫（30%）5ml，立刻放入消化爐開始消化。第三組，加樣品與試劑同第一組，消化管上蓋玻璃小漏斗放置過夜（14h）再放入消化爐開始消化。第四組，加樣品與試劑同第一組，消化管上蓋玻璃小漏斗放置過夜（14h）再加入AR過氧化氫（30%）5ml，放入消化爐開始消化。

3 測定方法

3.1 傳統方法

為國標方法GB5009.5-2003第一法，精密度為10%。適用于各類食品蛋白質的測定：取樣品0.5-1g（準確至0.0001g）， 放入消化管底部，加入混合催化劑2.5g放入消化管低部，濃硫酸20ml，玻璃珠三枚，上蓋玻璃小漏斗，放入消化爐開始消化，將消化爐電壓調至120v，過0.5h后再調至250v進行消化，消化好后按常規方法（凱氏定氮法）進行測定。

3.2 改進方法

取樣品0.5-1g（準確至0.0001g），放入消化管底部，加入混合催化劑2.5g放入消化管低部，濃硫酸20ml，玻璃珠三枚，上蓋玻璃小漏斗，放置過夜（14h），再加入過氧化氫5ml，放入消化爐開始消化，將消化爐電壓調至120v，過0.5h后再調至250v進行消化，消化好后按常規方法（凱氏定氮法）進行測定。

3.3 測定指標

測定樣品蛋白質消化時間：用四種分組方法測定樣品在蛋白質消化時所用的時間，測粗蛋白質含量：這四種分組方法在蛋白質消化好后，用同一種方法進行蛋白質蒸餾與滴定，計算粗蛋白質含量（系數6.25）。每一種樣品消化實驗做兩個平行樣，每個消化平行樣做兩個平行蒸餾滴定實驗。

3.4 測定方法

取5種樣品分別用以上四種分組方法分組，測定蛋白質消化時間進行比較，見表1；消化好的樣品通過傳統的凱氏定氮法進行蒸餾與滴定，并做空白滴定對照，算出各樣品粗蛋白質（%）含量，計算用下列公式：

CP=（V1-V2）×c×0.0140×F/m×100

CP：為樣品中粗蛋白質的百分含量；

V1：為樣品消耗鹽酸標準溶液的體積（ml）；V2：為式劑空白消耗鹽酸標準溶液的體積（ml）；C：為鹽酸標準溶液的濃度（mol/L）；m：為樣品的質量（g）；F：為氮換算成粗蛋白的系數為6.25；

各樣品計算結果見表2。

4 數據處理

經DPS數據處理系統作單因素方差分析，用LSD法作多重比較。

5 結果與分析

表1 不同方法消化對消化時間的影響 單位：小時（h）

由表1可知，不同試驗組蛋白質消化所用的時間不同，第一組最長，第四組最短，第一組平均消化時間為6.08小時，第四組平均消化時間為3.44小時，第四組比第一組消化時間平均縮短2.64小時，差異極顯著（p<0.01）；第二組平均消化時間為4.94小時，第三組平均消化時間為4.7小時，第二組與第三組之間差異不顯著（P>0.05），但與第一組比較，差異極顯著（p<0.01）。

表2 不同方法測定粗蛋白（CP）含量比較 單位： %

由表2可知，不同試驗組用同一種蒸餾與滴定的方法所測定出粗蛋白質的含量，各組之間差異不顯著（P>0.05）。

6 討論

6.1 綜上所述，傳統凱氏定氮法測樣品中蛋白質時，樣品的消化時間很長，平均6.08小時，造成教學實驗費時費力且操心，或容易造成消化管燒干或炸裂而使實驗失敗，本文改進的新方法大大縮短了蛋白質消化的時間，平均為3.44小時，較傳統凱氏定氮法消化時間平均縮短了2.64小時，省時省力，使教學實驗按時完成。兩種方法所測得的粗蛋白質含量差異不顯著（P>0.05）。改進的新方法在教學實驗中多次應用，效果較好，試驗重復性較好。

6.2 實驗新方法中，將實驗樣品加入濃硫酸和催化劑試劑后過夜再消化，有助于對樣品的氧化與分解，在消化之前再加入少量過氧化氫（30%），有助于加快氧化反應。過氧化氫具有強氧化性，在酸性條件下的還原產物為H2O，過氧化氫在常溫可以發生分解反應生成氧氣和水（緩慢分解），在加熱或者加入催化劑（CuSO4·5H2O，Na2SO4）后能加快反應， 2H2O2 被加熱后生成2H2O+O2↑，因此加過氧化氫可加快消化過程。

7 結束語

綜上所述，改進的消化實驗新方法與傳統方法相比，在操作步驟上有所改進，縮短了消化時間，又不影響蛋白質含量測定結果，操作簡單易行，經過多個班級教學實驗應用，效果較好，易于推廣。

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作者簡介：雷紅（1966-），女，高級實驗師，碩士，主要研究方向為飼料檢測與分析。