老年人口腔細胞角蛋白與口腔扁平苔蘚關系的臨床研究

[摘要] 目的 探討老年患者口腔CK與OLP的相關性，為臨床的疾病診斷和制定治療方案提供依據。 方法 32例病例樣本來源于我院口腔科經病理學檢驗確診的OLP患者頰部病變組織，為研究組；另取同期口腔拔牙患者健康口腔黏膜組織30例，為對照組；進行樣本制備和垂直電泳處理，觀察兩組樣本的CK陽性情況。 結果 研究組患者CK2、CK4和CK5陽性率明顯低于對照組，而研究組CK10、CK13和CK14的陽性表達率明顯高于對照組（P<0.05）。 結論 口腔細胞角蛋白與口腔扁平苔蘚的發病有一定相關性，CK2、CK4、CK5的淺表達和CK10、CK13、CK14的過表達，影響上皮細胞組織的增殖、分裂、角化等，進而影響OLP的發病。

[關鍵詞] 老年患者；口腔細胞角蛋白；口腔扁平苔蘚；相關性

[中圖分類號] R781.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）25-0149-02

老年人體質差，易發生各類口腔感染。口腔扁平苔蘚（OLP）是一種較為常見的口腔內慢性非感染性病變，主要發病于口腔黏膜，表現為上皮的過度角化，可累及口腔頰、牙齒、舌等其他部位的黏膜組織，屬于免疫反應性疾病的一類[1]。目前臨床對OLP的治療比較困難，易反復且有惡性傾向，被世界衛生組織（WHO）列入到癌前狀態范疇中。研究表明，細胞角蛋白（CK）與上皮角質細胞的增殖具有相關性[2]。CK屬于角質細胞中的骨架性蛋白，多于上皮細胞中表達，具有組織分化的特異性和高度保守性[3]。為探討老年患者口腔CK與OLP的相關性，給臨床的疾病診斷和制定治療方案提供依據，早期遏制癌變，筆者選取我院自2011年6～12月間收集的OLP標本共32例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

32例病例樣本來源于我院口腔科經病理學檢驗確診的OLP患者頰部病變組織，為研究組，其中男18例，女14例；年齡60～82歲，平均（69.4±5.3）歲；排除服用激素類藥物患者和有口腔黏膜病變者。另取同期口腔拔牙患者健康口腔黏膜組織30例為對照組，其中男15例，女15例，年齡60～78歲，平均（66.2±4.8）歲。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用北京天誠活德生物技術有限公司提供的DYY-12C型號電泳儀，由同廠提供的DYCZ-30型夾芯式垂直電泳槽。紫外可見分光光度計由上海精密儀器儀表有限公司供應，型號UV-3200PCGLP。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜由美國BIO-RAD伯樂公司生產。鼠抗人廣譜細胞角蛋白（P-CK）單克隆抗體由上海麗臣生物科技有限公司供應，配有ELISA試劑盒。辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG由上海萬安生物科技有限公司提供。DAB染色試劑盒由北京賽馳生物科技有限公司提供。

1.2.2 樣本制備 取兩組口腔黏膜標本各分為2份，一份行病理學HE染色驗證確診，一份行樣本制備與檢測。將口腔黏膜標本置入濃度3 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）無鈣鎂磷鹽緩沖液中，置于37℃環境下靜置2 h后取出，利用顯微外科組織鑷在10×4倍的觀察視野下分離上皮組織。分離后的上皮組織置入碾缽中，加入液氮研磨至粉末狀，再加入高鹽緩沖液1 mL，于4℃環境下勻漿1 h后，移入離心管進行離心處理10 min，轉速5 000 r/min，棄除上清液后，將沉淀物重懸于低鹽緩沖液中，繼續混勻攪拌，于4℃環境下移入離心管離心處理5 min，轉速5000 r/min，再次棄除上清液，將沉淀物以PBS洗滌5 min，第3次離心，轉速5 000 r/min，棄除上清液，沉淀物加入細胞角蛋白溶解液1 mL后于沸水浴中攪拌7 min，冷卻后再行離心，離心后上清液用紫外分光光度計測定蛋白定量，蛋白濃度為2.5 μg/μL。

1.2.3 電泳 進行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，凝膠上的樣孔均勻分為兩份，各放入5個樣本，兩份樣本一一對應。兩份凝膠一份使用考馬斯亮藍R250進行染色處理后觀察色帶變化情況，另一份應用Western雜交電泳處理，證實獲得蛋白條帶屬于角蛋白。各樣品槽內加樣，濃縮膠5%，分離膠12%。電泳后將凝膠切取一半移至PVDF膜上，再使用封閉液封閉好，于4℃環境下靜置過夜，次日加入抗CK抗體，靜置于4℃環境下過度，再以PBST液洗滌PVDF膜，反復3次后，加入辣根過氧化物酶，二抗標記，置于37℃環境下行2 h振蕩，取出后用PBST洗滌PVDF膜，反復3次，參照DAB染色試劑盒的相關說明進行顯色處理。

1.3 統計學方法

獲得數據錄入統計學軟件包SPSS15.0中并建立數據庫進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

分別對研究組和對照組檢驗樣本中CK陽性率進行比較，兩組計數資料CK2、CK4和CK5、 CK10、CK13和CK14分別進行卡方檢驗，見表1，研究組患者CK2、CK4和CK5陽性率明顯低于對照組，而研究組CK10、CK13和CK14的陽性表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

OLP的病理改變與CK的變化密切相關。李寧等[4]研究指出，基底層細胞凋亡過程中角質形成細胞形成嗜伊紅小體，尤以OLP基底膜破壞區域、炎性細胞浸潤區域、上皮T細胞侵入區域等更為明顯。基底細胞可通過將抗原提呈給細胞毒性T細胞促成角質形成細胞形成免疫損傷的靶細胞，從而降低黏膜上皮的自我修復能力，促進OLP的形成及進展。CK主要于上皮組織細胞表達，屬于細胞中間絲的主要成分，研究認為其具有高度的組織和細胞特異性[5]。

CK2是二型細胞角蛋白，簡潔等[6]報道口腔黏膜中的角化上皮和非角化上皮一般情況下較少出現在CK2的表達。Presland等[7]研究OLP中未發現CK2的表達。在本組研究中，研究組的CK2無表達，對照組的CK2表達陽性率僅20%，與相關報道相符，提示在正常口腔黏膜組織中可能存在不穩定CK2，但OLP可能引起DK2的表達減少甚至是消失。CK4屬于上皮分層和非角化標志，一般和CK13形成角蛋白對，于口腔上皮組織中呈現。CK5屬于基底層標志，一般是與CK14呈現角蛋白對，二者可形成彈性纖維網，從而適應細胞分裂以及組織形成變化，為細胞的形變提供環境。在本組研究中，CK4、CK5在研究組中的表達均極少，在對照組中表達相對多，與CK2的表達相似，筆者認為可能是OLP的進展引起CK4和CK5的減少或消失。CK2、CK4、CK5在OLP中表達不足可作為臨床研究的一種現象，但其消失過程及誘因等仍需進一步的臨床深入研究。

CK10、CK13和CK14是目前對OLP研究中較為關注的幾種角蛋白，毛良軍[8]直接對該三種CK的顯微鏡下表現進行報道，并指出該三種CK表達的變化與OLP病灶的角化、增殖和分化有關。CK10作為角化標志，在角化復層的鱗狀上皮基底層中表達，在細胞角化的過程中產生變化。CK10過度表達可能會致使上皮細胞的角化和分化，在本組研究中研究組DK10陽性率明顯高于對照組，提示CK10在OLP中存在過度表達，可能也是引發OLP發病及進展的因素之一。CK13屬于細胞分層與分化的標志，主要于頰黏膜上皮的基底組織上層表達，臨床可通過CK13的表達了解上皮組織的分化與成熟情況。在本組研究中，研究組CK13陽性率明顯高于對照組，提示CK13的表達過度可能影響OLP上皮細胞的分化與分層。CK14屬于基底層的標志，主要集中表現在基底層細胞中，由于基底層細胞具有較高的分裂與增殖能力，因而CK14的變化可表達細胞分裂增殖的能力與程度。在本組中研究組CK14陽性率明顯高于對照組，提示CK14的過度表達可能影響到OLP上皮細胞加強增殖與分裂，從而引發病變或加重病情。

總之，口腔細胞角蛋白與口腔扁平苔蘚的發病有一定相關性，CK2、CK4、CK5的淺表達和CK10、CK13、CK14的過表達，影響上皮細胞組織的增殖、分裂、角化等，進而影響OLP的發病。當然，CK與OLP相關性之間的病理因素仍需要進一步研究獲得。

[參考文獻]

[1]田燕，劉瑋，吳延芳，等. 細胞分化標志分子在扁平苔蘚皮損中異常表達的研究[J]. 臨床皮膚科雜志，2010，31（8）：448-450.

[2]汪群，諸煥穎，孫紅英. 人口腔扁平苔蘚角質形成細胞的體外培養及生物學鑒定[J]. 復旦學報，2007，34（5）：776-778.

[3]毛良軍，古亞蘭，聶敏海，等. 細胞角蛋白10、13、14和19在OLP中的表達研究[J]. 臨床口腔醫學雜志，2007，23（12）：710-712.

[4]李寧，翦新春. 口腔扁平苔蘚中細胞角蛋白19的表達及意義[J]. 臨床口腔醫學雜志，2008，24（5）：307-309.

[5]于世鳳. 口腔組織病理學[M]. 第5版. 北京：人民衛生出版社，2006： 200-202.

[6]簡潔，聶敏海，古亞蘭，等. 細胞角蛋白在口腔扁平苔蘚中表達的電泳研究[D]. 瀘州醫學院，2008：1-32.

[7]Presland RB，Dale BA. Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity：function in health and disease[J]. Crit Rev Oral Biol Med，2010，11（4）：383-386.

[8]毛良軍. CK10、CK13、CK14、CK19在口腔扁平苔蘚中的表達研究[D]. 瀘州醫學院，2007：12-53.