內質網、線粒體與腦缺血再灌注

[摘要] 內質網和線粒體是細胞內合成、分泌、加工和運輸蛋白質等物質以及維持機體能量代謝穩定的重要場所，然而在面臨創傷、缺血、缺氧等環境因子超負荷作用時，又通過復雜的病理生理過程最終導致細胞凋亡，甚至死亡。腦卒中是臨床上的常見病，腦缺血再灌注損傷是影響卒中患者治療效果的首要因素之一，是醫務工作者及患者所共同面臨的棘手問題。目前，線粒體和內質網應激途徑在誘導細胞凋亡及抗細胞凋亡研究中的地位日趨明顯，內質網應激與線粒體通路及其在腦缺血再灌注損傷中的研究具有重要意義。

[關鍵詞] 內質網；應激；線粒體；通路；腦缺血再灌注損傷

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）23-0020-03

缺血/再灌注損傷是指在缺血的基礎上恢復血流后組織損傷反而加重、甚至發生不可逆性損傷的現象。自由基作用、細胞內鈣超載和白細胞激活是缺血再灌注損傷的重要發病學環節，而細胞凋亡被認為是腦缺血再灌注損傷的主要環節[1]。內質網應激和線粒體通路是生物學界目前闡明得最為清楚的信號通路，也是發展最為迅速的領域。最近研究表明，內質網線粒體耦聯結構是內質網和線粒體間的重要連接紐帶[2]，通過內質網應激聯合線粒體通路的協同效應可誘導神經細胞凋亡，也可發揮神經細胞保護作用[3，4]。現就內質網與線粒體的結構功能及其在腦缺血再灌注損傷中的協同作用研究做一綜述。

1 內質網和線粒體的結構與功能

1.1內質網的結構與功能

內質網是一類由大小、形態各異的膜性管、囊泡所構成的連續膜性三維管網狀結構的細胞器，與蛋白質的分泌合成、加工修飾及轉運過程密切相關，為新生多肽鏈的正確折疊和裝配提供了有利環境。在細胞不同生理功能狀態下，內質網的形態結構、數量分布及發達程度都會出現明顯的差別，且始終處于一個形態結構不斷變化的動態之中[5]。內質網膜中葡萄糖-6-磷酸酶是糖代謝的關鍵酶和內質網的主要標志性酶[6]。葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein78， GRP78），即內質網分子伴侶重鏈結合蛋白，是熱休克蛋白70家族的成員之一，葡萄糖調節蛋白94（glucose regulated protein94，GRP94）與熱休克蛋白90的基因有50%同源且結構類似。GRP78和GRP94已成為內質網分子伴侶蛋白系統的重要組成部分，被視為內質網的兩個標志性分子伴侶[7]。

1.2線粒體的結構與功能

線粒體是由雙層單位膜套疊而成的封閉性膜囊結構，與細胞呼吸與能量轉換密切相關，是細胞中含酶最多的細胞器。線粒體內膜上的非特異性通透性轉運孔（the permeability transition pore， PTP）和外膜上的線粒體凋亡誘導通道（the mitochondrial apoptosis-induced channel，MAC）是線粒體膜上的兩個重要通道[8]。線粒體對機體內環境變化非常敏感，特別是缺血性損傷時線粒體會因膜電位改變或結構變異而導致膜通透性的改變，最終引起多系統病理生理表現。因此線粒體結構功能失調、DNA受損及蛋白表達異常等已成為細胞分子病理學檢查的重要依據，也常被視為細胞損傷最敏感的早期指標之一[9，10]。

1.3內質網和線粒體的結構功能耦聯

內質網線粒體耦聯結構由四種蛋白組成，分別是內質網側的內質網錨定蛋白Mmm1和線粒體側的線粒體相關蛋白Mdm10、Mdm12和Mdm34，他們與維持內質網線粒體的形態結構及功能密切相關[2]。內質網與線粒體在功能上相互影響、相互依存[11]。一方面，線粒體氧化磷酸化過程產生的ATP是內質網蛋白正確折疊的能量來源；另一方面，內質網蛋白折疊過程中產生的脂類物質又是線粒體膜賴以穩定的物質基礎。線粒體內質網關聯膜（mitochondria-associated ER membranes， MAMs）位于二者膜移行處，MAMs中富含鞘糖脂區域（glycosphingolipid-enriched microdomain，GEM）是控制內質網與線粒體間Ca2+流動的開關結構[12]，Ca2+是內質網與線粒體功能耦聯的離子基礎[5]。

2內質網應激和線粒體途徑在腦缺血/再灌注損傷中的作用

2.1內質網應激在腦缺血/再灌注損傷中的作用

2.1.1 內質網應激機制 內質網功能發生紊亂時，會出現錯誤折疊或未折疊蛋白在內質網腔內聚集和Ca2+平衡紊亂，這種現象稱為內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。內質網應激發生時，機體為了對抗其引起的細胞損傷，多種應激反應將被直接或間接激活，主要的信號通路有：①未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）；②內質網超負荷反應（endoplasmic reticulum-overloaded response， EOR）；③膽固醇調節級聯反應[13]，其中①和②系蛋白質加工紊亂所致；③系內質網表面合成的膽固醇減少所致，目前研究較為清楚的是UPR。通過上調或下調細胞的轉錄、翻譯水平UPR產生以下效應：①通過激活PERK暫時性下調蛋白質合成速度，進而減輕內質網蛋白加工負擔；②上調ERS相關蛋白的基因表達，進而促使錯誤折疊與未折疊蛋白恢復正常構象及維持內質網Ca2+平衡；③上調ERS降解途徑的相關基因表達，進而清除無法恢復正確構象的糖蛋白，避免異常蛋白在內質網過度堆積。但長時間過強的ERS會誘導細胞凋亡，常見的凋亡途徑有CHOP/GADD153激活通路、JNK激活通路和半胱氨酸蛋白酶caspase-12通路，其中caspase-12通路是內質網應激途徑所特有的[14]，正常狀態下caspase-12與GRP78結合，呈現無活性的前體蛋白。總之，內質網應激是一個存活與凋亡并存的過程，其中GRP78和GADD153分別是抗凋亡與促凋亡的兩個平衡因素[15]。

2.1.2 腦缺血/再灌注損傷與內質網應激 目前對腦缺血/再灌注損傷的機制研究較多，內質網應激與腦缺血/再灌注損傷關系密切，非折疊蛋白反應是內質網應激的首要中心環節。腦缺血/再灌注時，通過氧化應激、鈣超載等機制造成神經細胞損傷，進而引起內質網應激功能改變。病程初期，通過內質網應激反應可糾正錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白重新恢復正確的空間結構，然而長時程過強的內質網應激反應則引起神經細胞的凋亡，所以內質網應激效應與腦缺血再灌注時間窗密切相關。有研究表明[16]，兔在大腦中動脈阻塞2h再灌注不同時間點的caspase-12、凋亡細胞數有著類似的變化規律，說明內質網應激反應與神經細胞凋亡之間有密切關系；也有研究表明[17]，腦缺血再灌注后的不同時間點GRP78和GADD153的表達不對稱，缺血再灌注早期GRP78明顯升高，后期反而下降，GADD153在缺血再灌注后期明顯逐漸升高，說明內質網應激在早期發揮自穩功能以適應應激，后期以促使神經細胞凋亡為主。目前關于腦缺血的內質網應激途徑報道甚多[18，19]，但都無明確的機制可循。

2.2線粒體途徑在腦缺血/再灌注損傷中的作用

2.2.1 線粒體通路 Liu X等[20]早在1996年就已發現細胞色素C的釋放與細胞凋亡有明顯關系。在線粒體依賴性細胞凋亡途徑中，線粒體膜滲透性轉化孔開放、膜通透性升高和線粒體膜電位下降是線粒體形態功能改變的首要步驟，細胞色素C從線粒體內膜腔釋放到胞漿是該凋亡過程的重要環節[21]，釋放至胞漿的CytC可以與凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1）一起與caspase-9的前體結合，從而導致caspase-9的活化，后者可以激活caspase-3，最終引起細胞凋亡。膜上的BCL-2蛋白可阻止CytC釋放，BAX蛋白則促使CytC釋放。近年報道，3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）在多種疾病病理與細胞凋亡中都有過度表達[22]，能與線粒體膜上的電壓門控離子通道相互作用，使線粒體內膜透化作用增強、電位丟失、基質腫脹及CytC和凋亡誘導因子釋放增加。另有報道，GAPDH與非Caspase依賴性細胞死亡關系密切[23]。

2.2.2 腦缺血/再灌注損傷與線粒體通路 中樞神經系統對缺血缺氧非常敏感，常引起中樞神經系統功能障礙，甚至細胞死亡，線粒體功能障礙在缺血缺氧性腦損傷發生過程中起關鍵作用，線粒體膜上的MPTP是該過程的中心環節[24]。另外，腦缺血/再灌注損傷可引起神經細胞內外Ca2+紊亂，使細胞內Ca2+濃度增加，同時刺激線粒體攝入更多Ca2+，導致線粒體內出現Ca2+超載。Ca2+超載促進線粒體膜上的滲透性轉化孔開放，導致線粒體腫脹破裂，釋放細胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子-1、凋亡誘導因子等與細胞凋亡密切相關的因子。腦缺血/再灌注損傷也可引起線粒體膜上的多種離子通道，特別是線粒體ATP敏感性K+通道，其功能狀態直接影響線粒體乃至細胞的功能。在腦缺血缺氧時，SOD表達下調，ROS清除能力下降，ROS生成增多，抑制細胞色素C氧化酶mRNA轉錄，使電子傳遞鏈必需蛋白的合成減少，破壞電子傳遞，最終損傷腦組織。另外，線粒體也可通過壞死機制進而引起神經細胞死亡。

2.3內質網應激和線粒體通路在腦缺血/再灌注損傷中的聯系

在各種損傷因素作用下，細胞會通過不同的途徑和機制走向死亡，其中由內質網應激和線粒體所誘導的細胞凋亡途徑起重要作用。內質網應激途徑與線粒體途徑之間的相互作用大體分為三種途徑：內質網應激激發線粒體途徑、線粒體功能失調誘導內質網應激反應途徑與內質網應激和線粒體交互作用途徑。本世紀初，Ito Y等[25]通過免疫電子顯微鏡觀測并確認內質網上存在絡氨酸蛋白激酶c-Abl，又由共聚焦顯微鏡證明c-Abl與內質網應激相關伴侶蛋白GRP78有共同的同源區域。內質網應激時，c-Abl轉運到線粒體，加速CytC的釋放而最終激發細胞凋亡。在c-Abl表達有缺陷的細胞中，內質網應激反應所致細胞凋亡明顯減少。野田病毒感染實驗中[26]，通過內質網應激反應上調的GRP78可與RNA依賴性RNA聚合酶相互作用而誘發線粒體依賴性細胞凋亡的發生。另外，借助于內質網與線粒體間的網狀關聯膜結構進行的內質網線粒體鈣循環是內質網應激反應聯合線粒體途徑誘導細胞凋亡過程的中心環節[27]。Costa RO等[28]在阿爾茨海默病患者的血小板中，通過細胞質雜交技術發現，細胞色素C氧化酶的活化導致了線粒體的功能障礙，后者又上調了由Aβ誘導的內質網應激反應蛋白GRP78，進而加快了神經細胞凋亡的速度。Ip SW等[29]從姜黃屬植物中提取的姜黃素可使內質網應激和線粒體的協同促凋亡作用加強，進而促使舌鱗狀細胞癌中SCC-4細胞的凋亡。

3 展望

缺血性腦卒中是神經系統的常見病和多發病，如何減輕腦缺血/再灌注損傷是影響神經功能轉歸的主要因素之一。缺血/再灌注損傷中神經細胞凋亡機制逐漸受到廣泛關注，其中內質網應激和線粒體通路業已成為研究的熱點。但是，內質網應激聯合線粒體途徑在細胞死亡中協同作用的研究尚處于初級階段，相關文獻報道甚少。針對內質網應激聯合線粒體的協同作用機制，綜合干預并抑制其協同效應，更大程度地延緩或減少神經細胞凋亡，為臨床上有效減輕缺血再灌注損傷治療提供新的思路。

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（收稿日期：2013-05-15）