色素上皮衍生因子對小鼠腎透明細胞癌模型的抑制研究

[摘要] 目的 研究重組人色素上皮衍生因子（rPEDF）在體內(nèi)抑制腎透明細胞癌組織血管生成從而抑制腫瘤生長。方法 腎透明細胞癌細胞株786-0以濃度為5×106/100 μL在裸鼠左腋部背側(cè)皮下注射，建立皮下移植瘤模型，分為兩組（每組6只）：對照組（藥物用PBS代替），1 μg/200 μL rPEDF治療組，每日1次，連續(xù)注射2周。測量腫瘤大小，腫瘤組織行HE染色和免疫組織化學方法檢測CD34標記的微血管。 結(jié)果 PBS對照組與rPEDF治療組移植瘤平均體積分別為（1672.23±65.28）mm3和（1202.44±56.34）mm3，抑瘤率為28%，兩組比較差異有顯著性（P = 0.034）。PBS對照組與rPEDF治療組小鼠移植腎透明細胞癌組織中微血管密度（MVD）平均為（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍鏡視野，治療組小鼠移植腎透明細胞癌組織中MVD減少65%，兩組比較差異具有顯著性（P = 0.006）。 結(jié)論 rPEDF治療組小鼠移植瘤微血管密度明顯減低，移植瘤的體積也相應(yīng)減低，提示rPEDF能抑制血管新生，減緩腎透明細胞癌生長。

[關(guān)鍵詞] 腎癌；裸鼠；色素上皮衍生因子；血管生成

[中圖分類號] R737 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）23-0010-02

腫瘤的生長依賴腫瘤血管的生成，抑制腫瘤血管的生成，能切斷腫瘤生長的營養(yǎng)供應(yīng)途徑，阻斷腫瘤血運侵襲轉(zhuǎn)移途徑，從而有效遏制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，是治療腫瘤的有效方法。PEDF能抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，抑制血管管狀形成；體內(nèi)移植瘤模型實驗結(jié)果表明，PEDF有效抑制新生血管的形成，并能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌組織PEDF的表達與腫瘤微血管密度成反比[1]，是否應(yīng)用重組人色素上皮衍生因子（rPEDF）在體內(nèi)抑制腎透明細胞癌組織血管生成，導致腫瘤萎縮？在前期的研究結(jié)果基礎(chǔ)之上，我們采用皮下接種的方法建立裸鼠的腎透明細胞癌模型，經(jīng)過rPEDF的治療，測定兩種方法的抑瘤率，采用免疫組化方法檢測腎透明細胞癌模型微血管密度的變化，從而判定rPEDF對腎透明細胞癌血管生成及腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組處理

1.2 腫瘤微血管密度計數(shù)

MVD 檢測方法按Weidner[2]等法，CD34定位于血管內(nèi)皮細胞胞漿，呈棕黃色。先在低倍鏡（4×10）下觀察整個切片，選取血管內(nèi)皮細胞染色清晰，背景對比良好、微血管數(shù)量最密集的視野，再在高倍鏡（20×10）下觀察每單位面積（0.723 mm2）組織內(nèi)CD34單克隆抗體標記的微血管（MV）數(shù)。結(jié)果以5個高倍（20×10）視野MV數(shù)的均數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS15.0軟件進行分析，腫瘤體積和微血管密度均為連續(xù)計量資料，采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠腫瘤體積情況

所有裸鼠移植瘤的發(fā)生率為100%，兩組小鼠移植瘤均經(jīng)HE染色確認為透明細胞癌，在整個實驗過程中無裸鼠死亡，經(jīng)注射rPEDF和PBS后，完成兩周治療后第4天，PBS對照組與rPEDF治療組移植瘤平均體積分別為（1 672.23± 65.28）mm3和（1 202.44±56.34）mm3，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t = 2.467，P = 0.034），抑瘤率為28%。

2.2 免疫組化檢測腫瘤微血管密度

兩組小鼠移植瘤組織中均可見CD34標記的微血管，提示移植瘤組織中有大量新生血管的存在，微血管呈網(wǎng)狀、管狀散在或彌漫分布，血管形態(tài)差異性較大。PBS對照組與rPEDF治療組小鼠移植瘤組織中MVD平均分別為（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍鏡視野，兩組比較差異具有顯著性（t = 3.421，P = 0.006），rPEDF治療組小鼠移植腎透明細胞癌組織中MVD減少65%。

3 討論

外科手術(shù)是治療腎透明細胞癌唯一有效的方法，但僅局限早期腎癌，有30%的患者可出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因腎透明細胞癌中有多種耐藥蛋白過度表達，常規(guī)化療收效甚微，已經(jīng)發(fā)生腎癌轉(zhuǎn)移的患者5年生存率仍然非常低，中位生存期只有12個月。非特異性免疫治療白細胞介素-2（IL-2） 或干擾素α或聯(lián)合化療雖被公認是第一線方案，但只有少數(shù)患者明顯受益，有效率僅有15%，其他的治療方式諸如基因治療、激素治療等，療效不肯定或無效，因此，尋找腎細胞癌新的預(yù)后指標和治療方法非常重要[3，4]。

1963年Folkman等[5]發(fā)現(xiàn)有效抑制腫瘤血管的生長能阻止腫瘤的生長。1971年Folkman[6]又提出了腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生長，認為有效抑制腫瘤血管的新生可以治療腫瘤，腫瘤生長需要新生的血管，當腫瘤體積超過1～2 mm3，如沒有血管的新生，腫瘤細胞就會死亡，新生血管的數(shù)量關(guān)系到腫瘤生長速度。曾有鼠移植瘤的研究結(jié)果表明[7]：當無血管時，移植瘤生長緩慢，呈線性生長，而當有血管生成時，移植瘤生長迅速，呈指數(shù)生長。

大部分腎透明細胞癌患者由VHL基因突變造成HIF-1α相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，使VEGF、PDGF等多數(shù)生長因子過度表達，使血管內(nèi)皮細胞過度分裂增殖，使新生血管增生，造成腎透明細胞癌是一種富有血管的實體腫瘤，而且腫瘤的微血管密度與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。對于腎透明細胞癌的生物靶向治療就是抑制這些過度表達的血管生長因子[8，9]。使用單克隆抗體可以直接抑制過度表達的VEGF、PDGF、 EGF、TGF-α等血管生長因子，從而抑制腫瘤新生血管的形成，從而可以阻斷腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。目前這些治療腎透明細胞癌研究取得一定的進展，在臨床上也有一定的治療效果。

1999年 Dawson[10]發(fā)現(xiàn)了PEDF能有效抑制血管的新生，是目前最強的內(nèi)源性血管生成抑制因子，其抑制血管新生的能力是血管抑素的2倍，是內(nèi)皮抑素的7倍。Abramson等[11]報道PEDF能有效抑制Wilms瘤的生長，正常腎小管上皮細胞中PEDF表達量明顯高于Wilms瘤中PEDF表達，由于PEDF的低表達降低了抑制腎Wilms瘤中血管新生的能力，從而導致Wilms瘤的血管密度增加，rPEDF可抑制Wilms瘤的生長。

我們曾報道[1]，腎透明細胞癌的PEDF表達與腫瘤MVD呈負相關(guān)，PEDF表達陽性者生存時間長于PEDF表達陰性者。為了研究rPEDF對動物移植腎透明細胞癌是否有相同的作用，我們建立小鼠的腎透明細胞癌動物模型，采用rPEDF瘤內(nèi)注射組及PBS瘤內(nèi)注射組。我們通過CD34來標記腫瘤新生微血管，通過檢測小鼠移植腎透明細胞癌的微血管密度來確定rPEDF對腎透明細胞癌血管新生是否有影響，我們的結(jié)果表明rPEDF瘤內(nèi)注射組的腫瘤微血管密度明顯低于PBS注射組，另外我們還發(fā)現(xiàn)rPEDF治療組的腫瘤在接受2周的rPEDF移植瘤瘤內(nèi)注射后，移植瘤的直徑明顯小于只接受PBS注射的對照組，PEDF對腎透明細胞癌新生血管的抑制可有效抑制腎透明細胞癌增殖生長。雖然接受rPEDF瘤內(nèi)注射后腫瘤微血管密度下降程度大于腫瘤體積的下降程度，考慮腎透明細胞癌組織具有豐富的微血管，降低部分血管密度，腫瘤組織仍可靠周圍的細胞進行營養(yǎng)彌散擴張，只有明顯降低微血管，才能減慢腫瘤生長。

國外研究表明[12]，rPEDF選擇性抑制新生血管的生長，不能抑制本身已經(jīng)存在的血管，另外研究[13]表明PEDF只對血管內(nèi)皮細胞有抑制作用，rPEDF不能抑制成纖維細胞及平滑肌細胞，基于PEDF能特異性抑制腫瘤血管的新生，對于腎透明細胞癌的治療具有良好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2013-03-04）