正交實驗優選潤肺散結膠囊提取工藝的研究

[摘要] 目的 篩選潤肺散結膠囊的最佳提取工藝。 方法 采用正交實驗設計，以人參皂苷Rb1的含量和水提浸出物得率為考察指標，以加水量、煎煮時間、煎煮次數為考察因素，優選煎煮工藝；以濃縮液相對密度、醇沉濃度、醇沉時間為考察因素，優選醇沉工藝。 結果 最佳提取工藝為煎煮3次，第1、2次分別為1.5 h，加8倍量水；第3次1 h，加6倍量水；濃縮液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，醇沉18 h。 結論 該工藝簡便，方法準確可靠，制成品質量穩定。

[關鍵詞] 潤肺散結膠囊；正交實驗；煎煮工藝；醇沉工藝

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）22-0075-03

潤肺散結膠囊是廣西柳州市中醫院通過臨床實踐研制出的純中藥制劑，由紅參、海浮石、麥冬、百合、瓜蔞、半夏等14味中藥組成，具有益氣養陰、化痰散結之功效。從2004年7月起，我院腫瘤科、藥學部將潤肺散結湯作為院內協定方劑已經治療肺癌600余例，效果良好。其中系統觀察了潤肺散結膠囊治療氣陰兩虛痰濁泛肺型非小細胞肺癌72例，治療組采用潤肺散結湯口服并加用化療（36例），對照組采用單純化療（36例）。觀察顯示，潤肺散結膠囊合并化療，臨床療效可靠，主癥好轉率治療組（87.15%）明顯高于對照組（64.08%）；生活質量的好轉和穩定方面、毒副反應發生率、完成化療方面，治療組也明顯優于對照組[1]。證明潤肺散結膠囊是治療氣陰兩虛、痰濁泛肺型非小細胞肺癌的有效制劑，值得臨床推廣應用。此外，我們還進行了潤肺散結膠囊對Lewis肺癌（荷瘤）小鼠的抑瘤作用實驗。實驗結果表明，潤肺散結膠囊對體外培養的Lewis肺癌細胞有明顯的抑制作用，其機制可能為誘導腫瘤細胞凋亡和提高機體免疫功能[2]，為臨床用藥和本課題的深入研究提供了理論依據。為了更好地控制其質量，為制備工藝提供科學性依據，本文以人參皂苷Rb1含量和水提浸出物得率作為提取工藝評價指標，采用正交實驗法對提取工藝進行系統考察，以篩選出最佳工藝。

1 儀器與試藥

DH64型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫療器械一廠）；KQ-200VDE型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CAL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KDM可調控溫電熱套（山東鄄城科源儀器設備廠）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；HP-01無油真空泵 （上海市躍進醫療器械一廠）；LK-1000A型搖擺式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市創力藥材器械廠）；GC2105格力電磁爐（格力電器中山市小家電制造有限公司）。

紅參、鱉甲、瓜蔞（廣西柳州百草堂藥業有限公司，批號：20110208）；百合、法半夏、麥冬、白英（國藥控股柳州有限公司，批號：20110211）；玄參、靈芝、炙甘草、生地黃、炮山甲（廣西柳州百草堂藥業有限公司，批號：20110126）；海浮石、生牡蠣（廣西萬豐藥業有限公司，批號：20110209）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥材吸水率試驗

按處方比例稱取1/4處方量藥材6份，分別加入10倍量水，放入6個500 mL以上的燒杯中，編號，于不同時間濾出浸泡液，精密稱定吸液后的藥材重量，量取濾液體積，直至全部藥材浸泡過心、吸水量不再增加為止，見表1。

結果表明，吸水率約為藥材重量的146%，故第一次煎煮時應多加1.26 倍量的水。

2.2 煎煮工藝正交實驗設計

結合文獻報道[3，5]，以加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）為主要考察因素，以人參皂苷Rb1含量和水提浸出物得率為考察指標，以兩項指標分別占60和40、總分為100分進行綜合評分，設計每個因素選擇三個水平進行實驗，采用L9（34）正交設計法對提取工藝進行優化。煎煮工藝的因素水平見表2；煎煮工藝正交實驗結果見表4；方差分析結果見表5。

2.3 煎煮試驗樣品的制備

將處方中各藥材粉碎成粗粉，按比例稱取適量，根據表2的安排加水煎煮提取，煎煮前用規定量水浸泡。煎煮液用四層紗布濾過，合并，濃縮至200 mL，即得9份煎煮液，冷卻置于冰箱，保存備用。

2.4 人參皂苷Rb1含量測定[6]

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.05%磷酸溶液，流動相B：乙腈，按表3進行梯度洗脫；流速：0.8 mL/min ；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；理論塔板數按人參皂苷Rb1色譜峰計算不低于5 000，與相鄰色譜峰的分離度>1.5。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1對照品適量置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度1.020 mg/mL 的人參皂苷Rb1對照品溶液備用。

2.4.3 供試品溶液的制備[7] 取潤肺散結膠囊樣品內容物約10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（30℃～60℃）100 mL，加熱回流2 h，棄去石油醚，揮干藥渣溶劑，加甲醇提取至無色，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加水60 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉移至10 mL量瓶中，加甲醇到刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 陰性對照液的制備 按“2.3 煎煮試驗樣品的制備” 項下方法制備得到一份缺紅參藥材的煎煮液，后按上述 2.4.5 供試品溶液的制備 項下方法同法制備，得到缺紅參的陰性對照液。

2.4.6 樣品測定 取人參皂苷Rb1對照品加甲醇溶解后在200～400 nm波長下掃描，最大吸收峰位置與2010年版中國藥典下相同，均為203 nm。分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液，注入高效液相色譜儀，以外標兩點法計算含量，結果見表3。

2.5 得膏率的測定

分別精密移取10 mL煎煮液，置于已恒重的干燥蒸發皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥3 h，迅速置于干燥器放冷，稱重，計算得膏率。

2.6 煎煮工藝優選

見表4。

由表3、表4可知，因素C即提取次數對人參皂苷Rb1含量及得膏率的綜合結果影響有顯著性，因素A和因素B對本試驗體系的影響沒有統計學意義，即加水倍數和煎煮時間對于試驗結果影響不大。影響程度依次為C>A>B，因而確定最佳煎煮工藝為A2B2C3，即煎煮3次，第1、2次分別為1.5 h，加8倍量水；第3次1 h，加6倍量水。

2.7 醇沉工藝的正交設計

本實驗以濃縮液相對密度（A）、醇沉濃度（B）、靜置時間（C）為主要考察因素，以人參皂苷Rb1含量為考察指標，設計每個因素選擇三個水平進行實驗，采用L9（34）正交設計法對醇沉工藝進行優化，醇沉工藝因素水平見表6；醇沉工藝正交實驗結果見表7；方差分析結果見表8。

2.8 醇沉試驗樣品的制備及測定

根據最佳煎煮工藝制備9份煎煮液，分別濃縮至相對密度（60℃時測）為1.05、1.10、1.15，冷卻后，按照醇沉工藝正交表，邊快速攪拌邊緩慢加入95%的乙醇，使含醇量達到各實驗號所要求的含醇濃度，按要求靜置、抽濾，沉淀用相應濃度乙醇兩倍量體積分兩次沖洗，合并濾液。濾液回收乙醇，濃縮液水浴蒸干，減壓干燥得到干膏，研細。稱取0.5 g干膏，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱重，超聲60 min，放冷，補重。濾過，得供試品溶液，按“煎煮工藝正交實驗設計”中“2.4人參皂苷Rb1含量測定”項下測定。

2.9醇沉工藝優選

見表6～8。由表7、表8可知，因素A對醇沉工藝的影響顯著，因素B、C基本無影響，影響程度依次為A>B>C，結合直觀分析表結果可以確定最佳醇沉工藝為： A1B2C2，即濃縮液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，靜置時間18 h。

2.10 工藝驗證試驗

取1倍量的處方投料，按照最佳煎煮工藝提取，合并煎煮液。按“2.4.3 供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，測定提取液中人參皂苷Rb1的含量，并測定浸膏得率，實驗數據及結果見表9；另取1倍量的處方投料，按照最佳煎煮工藝提取，最佳醇沉工藝處理，按“2.8醇沉試驗樣品的測定”項下自“按要求靜置”同法操作，測定干膏中人參皂苷Rb1的含量，實驗數據及結果見表10。由驗證實驗結果可見，按優化的條件重復操作3次，煎煮工藝中，人參皂苷Rb1的平均含量為0.667 2 mg/g，平均得膏率為31.00%，人參皂苷Rb1含量的RSD=3.72%，浸膏得率的RSD=2.31%；醇沉工藝中，醇沉后所得干膏中人參皂苷Rb1的含量平均為0.657 6 mg/g，RSD=2.89%，結果均比較理想。表明此煎煮和醇沉方法重現性好，工藝條件合理、穩定、可行。

3 討論

在實驗中，考慮到藥材的吸水性，因而對藥材的吸水率進行了考察，通過實驗得出該處方藥材的吸水率為146%，進一步提高了試驗的準確性。

本研究通過正交實驗確立了潤肺散結膠囊提取工藝中的一系列參數，為工業化生產條件的制定提供了參考依據。在研究中發現不同供應商及產地的藥材含量相差太大，如不同批次購買紅參中人參皂苷Rb1的含量相差數倍。故本研究中所優選最優水平的有關指標數值僅作為制劑工藝篩選依據，不宜作為制定質量標準的含量參考。

因紅參為方中君藥，人參皂苷Rb1為紅參有效成分之一，在水提工藝中采用高效液相法測定提取物中人參皂苷Rb1的含量，并以此評價工藝的優劣，故其為重要指標之一，權重系數定為0.6。另將得膏率作為大類成分間接控制的指標，考察水提液得膏率量，確定權重系數為0.4。通過正交試驗，確定了最佳的提取工藝。確定的提取工藝操作簡單，重復性好，提取效率高，在制備潤肺散結膠囊的過程中有較高的應用價值。

[參考文獻]

[1] 王三虎，王宗仁，馮獻斌，等. 潤肺散結膠囊治療氣陰兩虛痰濁泛肺型非小細胞肺癌臨床觀察[J]. 中國中醫急癥，2007，16（10）：1158-1186.

[2] 王三虎，王宗仁，王四旺，等. 潤肺散結膠囊抗小鼠Lewis肺癌的實驗研究[J]. 中國中西醫結合急救雜志，2008，15（5）：289-292.

[3] 梁學政，陳惠紅，唐勇琛，等. 正交實驗優選弱視明口服液的提取工藝[J]. 中國藥房，2011，22（31）：2914-2916.

[4] 任振學，張燕平. 正交實驗法優選消黃靈注射液水煎煮提取工藝的研究[J]. 解放軍藥學學報，2001，17（6）：338-339.

[5] 李榮，胡成穆，鐘明媚，等. 正交設計研究金銀花綠原酸煎提工藝[J]. 安徽中醫學院學報，2006，25（1）：39-40.

[6] 國家藥典委員會編. 中華人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2010：8，143.

[7] 姜澤，李東飛，姚維民，等. 補金片質量標準研究[J]. 中國現代中藥，2011，13（4）：37-40.

[8] 張愛麗，潘衛東. 補腎健骨片水煎藥材的提取、純化及制劑工藝研究[J]. 淮海工學院學報[J]. 2007，16（4）：43-45.

（收稿日期：2013-03-21）