利用SSR分子標記鑒定雜交稻種子齊兩優918純度

摘要：種子純度是雜交水稻種子質量的核心指標。微衛星技術（SSR分子標記技術）因其具有穩定性好、準確可靠、易于操作等優點在種子純度鑒定中得到了越來越廣泛的應用。采用48個SSR分子標記對雜交水稻組合齊兩優918的雙親及F1之間的多態性進行篩選和純度檢測技術研究，為種子生產以及種子上市銷售做好質量監督，杜絕質量風險。經過篩選得到如下結果：在對48對引物進行篩選后，發現有5對引物在雙親間顯示穩定多態性，在雜種F1上表現為父母本共顯性條帶，表明該5對引物適宜于齊兩優918雜交種子純度鑒定，可用于種子質量監控。

關鍵詞：雜交水稻；種子純度鑒定；微衛星分子標記（SSR分子標記）

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）17-120-02

種子純度是雜交水稻種子質量的核心指標，是種子質量分級的主要標準，是企業購銷種子的關鍵依據，歷來受到種子管理部門、種子企業和農民的密切關注。而無論三系還是兩系雜交稻，高純度雜交種都是發揮雜種優勢增產潛力的基礎，種子純度不夠會給種植戶造成減產和巨大的經濟損失。

品種純度檢驗的方法很多，根據其所依據的原理不同主要分為形態鑒定、物理化學法鑒定、生理生化法鑒定、分子生物學方法鑒定、細胞學方法鑒定。其中分子測定技術又分為RFLP、AFLP、RAPD、SSR分子檢測技術。而SSR（Simple Sequence Repeats，簡單重復序列）分子技術是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛星DNA （Microsatellite DNA）技術，其SSR標記是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，具有以下優點：（1）數量豐富，覆蓋了整個基因組，揭示的多態性高；（2）具有多等位基因的特性，提供的信息量高；（3）以孟德爾方式進行遺傳，呈共顯性；（4）每個位點由設計的引物順序決定，便于不同的實驗室之間相互交流合作開發特異性引物。因而SSR分子檢測技術在種子純度鑒定中得到了廣泛應用。

筆者利用SSR分子檢測技術，對齊兩優918母本033S和父本R918進行擴增反應和電泳圖譜的分析，結果選出了5對引物，這5對引物對齊兩優918的母本033S和父本R918都顯示出了很好的多態性，并在齊兩優918上顯示出共顯性特征，因此適宜于對其進行純度鑒定以及質量監控。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 水稻種子齊兩優918的不育系033S在光照培養箱（恒溫30℃）中培養生長7d的幼苗；恢復系R918在光照培養箱（恒溫30℃）中培養生長7d的幼苗；雜交種（F1）齊兩優918在光照培養箱（恒溫30℃）中培養生長7d的幼苗。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 DNA的提取采用CTAB法：取一棵幼苗，用剪刀剪碎后放在2.0mL的離心管中，加入液氮，研至粉狀即可，然后在離心管中加入600μL的裂解液，把離心管蓋好放在65℃的水浴鍋里預熱30min，期間要每隔10min反復顛倒幾次。預熱后加入氯仿：異戊醇抽提液600μL，把離心管蓋好放入低溫高速冷凍離心機中以13 000r/min離心15～20min，然后把上清液轉移到1.5mL的離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，再放入離心機中以13 000r/min離心5min，倒出上清液，這時在底部就可以看到白色透明沉淀。再加入500μL的70%乙醇，離心2min，開蓋后將底部白色沉淀風干即可，加入100μL的TE緩沖溶液，-20℃保存備用。

1.2.2 PCR反應 PCR反應體系為：10×Buffer倍液，dNTP 0.12mmol/L，Mg2+ 1.5mmol/L，每種引物1μmol/L，0.2單位Taq酶，10ng的DNA，不足10μL的部分用超純水補足（共計10μL）。

PCR反應程序為：95℃預變性5min，然后94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，進行35個循環，再在72℃延伸7min。最后冷卻至4℃。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 把電泳槽裝好后在底部用1%的瓊脂凝膠封底，用聚丙烯酰胺凝膠溶液（8%的聚丙烯酰胺溶液+0.5%體積的10%過硫酸銨溶液+0.1%的TEMED）灌膠，快速插入梳子。在PCR擴增反應產物中加入溴酚藍指示劑，待膠凝固后進行點樣。按正負極接通電泳儀后，180～200V的電壓下跑電泳2.5h左右。將膠放入固定液（體積比0.5%乙酸和體積比10%的乙醇）中固定12min，然后倒去固定液，用染色液（AgNO3溶液）染色12min，倒去染色液，用純水漂洗2次，每次1～2min。最后將凝膠放入顯色液（體積比0.4%的甲醛溶液和質量體積比1.5%的NaOH溶液）中直至條帶出現，并拍照記錄。

2 結果與分析

齊兩優918及其親本用48對引物進行篩（下轉129頁）（上接120頁）選，有5對引物能在該組合顯示穩定的多態性，雜種表現父母本的互補帶型。圖1分別是選出的5對引物中3對核心引物（P1、P2、P3）在齊兩優918雙親及雜交種中表現出來的帶型數據。

由圖1可知：P1中，M代表20bp lander標準的DNA Marker，1、2、3、4為不育系033S，5、6、7、8為恢復系R918，9、10、12為雜交種，1′、2′、3′、4′為不育系033S，5′、6′、7′、8′為恢復系R918；9′、10′、11′、12′為雜交種。P2中，M代表20bp lander標準的DNA Marker，1、2、3、4為不育系033S，5、6、7、8為恢復系R918，9、10、11為雜交種，1′、2′、3′為不育系033S，4′、5′、6′、7′為恢復系R918，8′、9′、10′為雜交種。P3中，M代表20bp lander標準的DNA Marker，1、2、3為恢復系R918，4、5、6為不育系033S，7、8、9、10、11、12為雜交種。

雜交種純度鑒定時，一般檢測200粒種子，若樣品純度鑒定結果低于96%，將待檢測樣品數量增加至300粒進行驗證。雜交種純度計算公式為：純度（%）=雜交種樣品數/檢測樣品數×100。

3 總結與討論

SSR標記由于具有數量豐富、多態性高、遺傳上呈共顯性、實驗操作簡單、結果穩定可靠等優點，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標記。

實驗應用CTAB法提取DNA去糖效果好，更是采用了比一般反應體系更小的10μL反應體系，降低了檢測成本。但是實驗整個DNA提取過程大概需要5h，PCR過程需要130min，丙烯酰胺電泳大概2.5h，整個過程耗時太多，完成一個種子樣品的檢測大概需要2d，效率太低。以后需要對DNA提取、PCR反應體系和程序及凝膠電泳等方面進行技術體系的優化的研究實驗，縮短DNA提取、PCR反應體系和程序的時間，提高工作效率；改丙烯酰胺電泳為瓊脂糖電泳，瓊脂糖電泳能反復利用，大大降低成本，從而建立準確、簡單、快速、成本低廉的鑒定雜交種子純度的技術體系。 （責編：徐世紅）