頭花蓼愈傷組織誘導及分化

摘要：研究了2種外植體（葉片、莖段）、消毒方法、培養基種類、活性炭、植物生長調節劑等因素對頭花蓼愈傷組織誘導及分化的影響。結果表明，最佳消毒方法為以0.15%HgCl2消毒葉片6min和10%NaClO消毒莖段9min；不同培養基誘導愈傷組織發生率依次為MS>1/2MS>B5；MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L有利于愈傷組織形成；MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L有利于愈傷組織增殖；MS+6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L有利分化，分化率為83.33%，產生不定芽平均數為5.1個。培養基中附加100mg/L活性炭，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。

關鍵詞：頭花蓼；葉片；莖段；愈傷組織

中圖分類號 S58 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）17-21-04

花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don）別名四季紅、銅礦草、石辣蓼、石莽草等，屬蓼科蓼屬多年生草本植物，我國主要分布于西藏、廣東、四川、湖北、廣西、云南、貴州等省區，印度、越南也有生長，其中在我國有17種、7變種，資源十分豐富。頭花蓼是一種理想的彩葉花卉植物[1]，具有較高的觀賞價值，可作為垂直綠化、邊坡護理、地被綠化和觀花等的良好材料推廣應用[2]；也是一種重金屬耐受植物，在廢棄地的植物重建、修復中具有廣泛的應用價值；同時頭花蓼全草均可入藥，有清熱解毒、祛風止痛、去腐生肌的作用[3-4]。

頭花蓼需求量大且野生資源有限，快速繁育體系可以有效解決原料供應不足的問題。頭花蓼組織培養方面，尤其是愈傷組織培育研究較少。毛堂芬[5]和龍祥友[6]分別以頭花蓼帶節莖段、莖尖為外植體進行組培快速繁殖。筆者以頭花蓼的葉片、莖段為外植體，通過組織培養手段建立無菌培養體系，研究了不同類型外植體、消毒方法、培養基類型、活性炭、植物生長調節劑等因素對其愈傷組織誘導的影響，為頭花蓼愈傷組織的培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料頭花蓼采自重慶北碚縉云山，后栽植于西南大學園藝園林學院園林植物與栽培育種實驗室，進行常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種外植體的最佳消毒方法篩選 摘取頭花蓼剛展開葉片和不帶芽莖，在流水下沖洗1h，用蒸餾水反復沖洗3次。在超凈工作臺上，先用75%酒精進行表面消毒處理10～20s，分組后分別用0.15%HgCl2溶液浸泡2、4、6、8、10min，以及10%NaClO浸泡3、6、9、12min。外植體消毒后，用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，用無菌刀將葉片切成0.3cm2的小塊，莖段切成1cm左右的小段，在無菌的條件下接種在無激素的MS培養基中。每瓶接種3個外植體，接種10瓶，每組設3次重復。每3d記錄外植體污染數和存活數一次，以30d為周期統計其污染率和死亡率。

1.2.2 愈傷組織誘導

1.2.2.1 3種培養基對愈傷組織誘導的影響 取已建立的無菌體系苗，將切取好的葉片、莖段分別接種于含有6-BA1.0mg/L，NAA0.3mg/L的MS、1/2MS、B5的3種培養基上。

1.2.2.2 6-BA與NAA組合對外植體愈傷組織誘導的影響 選擇以上最佳培養基，分別以6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L，NAA 0.3、0.5mg/L為外源激素采取兩因素完全隨機組合設計。每瓶接種3個外植體，接種10瓶，每組設3次重復。每3d觀察記錄一次，以30d為周期，統計不同外植體愈傷組織及生長狀況。

1.2.3 愈傷組織增殖 無菌條件下，選取頭花蓼生長旺盛的胚性愈傷組織，切取直徑大小約為0.3cm的塊接種于MS培養基，培養基附加外源激素6-BA 0、2.0、4.0mg/L，NAA 0.2mg/L。90d（期間繼代2次）后，稱取愈傷組織的重量，在80℃下進行烘干，測得干物質含量。

1.2.4 愈傷組織分化

1.2.4.1 活性炭對愈傷組織誘導的影響 分別添加0、100、500mg/L活性炭，在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的培養基上誘導，觀察并記錄活性炭對愈傷組織誘導的影響。

1.2.4.2 不同濃度6-BA對不定芽誘導的影響 無菌條件下，將增殖的愈傷組織取出切成直徑大小約為0.5cm的塊，分別轉接到含有6-BA 0、2.0、4.0、6、8、10mg/L，IBA 0.1mg/L培養基上。

1.2.5 培養條件 除基本培養基和激素濃度篩選試驗外，培養基均采用MS固體培養基。培養基中含蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH值為5.8，于121℃高溫下滅菌20min。在光照強度1 600lx下光照16h/d，培養溫度25℃。

1.2.6 統計指標 外植體污染率（%）=（外植體污染數/外植體接種數）×100

外植體死亡率（%）=（外植體死亡數/外植體接種數）×100

愈傷組織誘導率（%）=（形成愈傷組織的外植體數/接種外植體總數）×100

分化率（%）=（形成不定芽的愈傷組織塊數/接種愈傷組織總數）×100

平均芽數=產生芽數/產生芽的愈傷組織數

2 結果與分析

2.1 2種外植體的最佳消毒方法篩選 由表1可知，對于0.15%HgCl2處理的葉片，消毒4～6min時，污染率急劇下降，消毒10min以后沒有污染，消毒效果較好；消毒6～8min時，葉片死亡率增加明顯，10min時葉片全部死亡。0.15%HgCl2處理莖段，消毒8min以后沒有污染；消毒8～10min時，死亡率增加明顯，10min時為98%。以10%NaClO處理2種外植體，經過實驗分析也出現以上相似趨勢。說明，采用0.15%HgCl2和10%NaClO處理頭花蓼葉片和莖段2種外植體時，隨處理時間的增加，其污染數目逐漸減少，污染率在降低；其存活數目逐漸減少，死亡率在增加。綜合分析，在頭花蓼愈傷組織培養過程中從外植體材料的低污染率和高成活率來考慮，最佳消毒方法為：以0.15%HgCl2處理葉片消毒6min，污染率為16.67%，死亡率為19%；以10%NaClO處理莖段消毒9min，污染率和死亡率均為13.33%。

2.2 愈傷組織誘導

2.2.1 3種培養基對愈傷組織誘導的影響 由表2可知，同一培養基條件下，葉片外植體愈傷組織誘導率普遍低于莖段愈傷組織誘導率，表明采用莖段作為外植體誘導愈傷效果較好。觀察發現，不同培養基中的愈傷組織多呈紅褐色，少帶綠色，其中MS培養基中愈傷組織生長狀況較好，且有少量芽點出現。在同等激素濃度下，頭花蓼2種外植體愈傷組織誘導率最高的為MS培養基，葉片和莖段誘導率分別為74%和82%；1/2MS培養基次之；最低為B5培養基。

2.2.2 6-BA與NAA組合對外植體愈傷組織誘導的影響 由表3可知，在以上最佳培養基（MS）中，添加不同濃度的6-BA和NAA配比，結果表明：在NAA濃度相同條件下，愈傷組織誘導率隨6-BA濃度增加逐漸上升，但當激素濃度超過最適數值時，愈傷組織誘導率有所下降。說明低濃度的6-BA處理有利于愈傷組織誘導，而高濃度又會抑制愈傷組織形成。NAA濃度隨6-BA濃度的變化，也出現以上類似規律。愈傷組織誘導中，適宜濃度6-BA和NAA共同作用將有利于植物細胞脫分化，愈傷組織誘導率較高。編號2培養基中，葉片、莖段2種外植體的愈傷組織誘導率最高，分別為73.33%和86.67%，最佳配比濃度為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L。編號1、6培養基愈傷組織誘導率最差。

2.2.3 愈傷組織的誘導觀察 觀察發現，不同編號培養基對頭花蓼外植體愈傷組織的誘導存在較大差異。葉片和莖段在接種7d左右，基部稍有膨大，傷口處開始變成紅褐色，產生極少量愈傷組織。接種28d后，外植體顏色加深，呈現出紅褐色，切口變皺，愈傷組織顯著膨大。愈傷組織的形成過程受植物外植體種類、培養基種類及成分和培養條件等諸多因素的影響，合適的條件有利于愈傷組織誘導體系的建立。

2.3 愈傷組織增殖 由表4可知，將愈傷組織接種到不同濃度6-BA的增殖培養基中，只添加NAA時，愈傷組織分化出根，不表現出生長；同時添加6-BA和NAA，愈傷組織表現出分化和生長狀態。當NAA濃度為0.2mg/L不變時，愈傷組織數量隨6-BA濃度增加呈現增加趨勢，由26.7%增加到86.2%，愈傷組織生長強于分化，生長趨于正常。說明僅有NAA時，有利愈傷組織分化，分化出氣生根；6-BA與NAA提高到合適濃度時，有利于愈傷組織增殖。最佳增殖濃度配比為6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L，增加率為86.2%，愈傷組織生長正常。

2.4 愈傷組織分化

2.4.1 活性炭對愈傷組織分化的影響 由表5可知，培養基中添加活性炭對頭花蓼愈傷組織褐化起抑制作用，愈傷組織褐變率隨活性炭濃度的增加呈現先降低后升高趨勢。未添加活性炭時，褐化率為35.20%，且褐化出現在切口周圍，程度嚴重；加100mg/L活性炭時，褐化率為6.8%，且褐化現象出現較少，并且程度較輕；加500mg/L活性炭時，褐化率為13.30%，褐化較嚴重，部分出現枯萎。說明活性炭對頭花蓼愈傷組織的褐變有一定的抑制作用，須選擇適宜的濃度。結果表明，加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。

2.4.2 不同濃度6-BA對不定芽誘導的影響 由表6可知，培養基中6-BA和IBA配合添加將有利于愈傷組織不定芽分化。觀察發現，6-BA濃度過低，愈傷組織會出現不定根；濃度過高時愈傷組織會褐化。IBA濃度在0.1mg/L時，隨著6-BA濃度增加，不定芽分化指數呈現升高趨勢。當6-BA濃度為8mg/L時，不定芽分化率最高，為83.33%；6-BA 6mg/L、10mg/L時，不定芽分化率次之，分別為63.33%和66.67%；6-BA 2mg/L時最低，分化率為16.67%。6-BA 6mg/L和8mg/L時，愈傷組織分化成不定芽的平均數最高，分別為5.2個和5.1個；其次為6-BA 10mg/L，愈傷組織分化成不定芽的平均數為4.6個。綜合考慮，頭花蓼愈傷組織不定芽誘導的最佳配合比為：6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率為83.33%，不定芽平均數為5.1個。

3 結論

頭花蓼外植體來源廣泛，能作為材料長期用于誘導建立愈傷組織無性系。最佳消毒方法為0.15%HgCl2處理葉片消毒6min；10%NaClO處理莖段消毒9min，且以莖段為外植體誘導愈傷組織較葉片效果更好。

材料自身差異導致培養條件存在略微不同。實驗發現MS培養基為最佳培養基，這與蔡能[7]報道相一致。在MS中添加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.3mg/L有利于形成愈（下轉55頁）（上接23頁）傷組織，同時發現MS+6-BA 4mg/L+ NAA 0.2mg/L為最佳增殖配合比。

活性炭對頭花蓼愈傷組織的褐變有一定的抑制作用[8]。附加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。以6-BA和IBA為激素配比，發現頭花蓼愈傷組織不定芽誘導的最佳配合比為6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率為83.33%，不定芽平均數為5.1個。

參考文獻

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[3]任光友，常風崗，盧秦琳，等.石莽草的藥理研究[J].中國中藥雜志，1995（2）：107-109，128.

[4]李孟林，梁斌，姚強，等.苗藥—頭花蓼研究綜述[J].中國醫院用藥評價與分析，2005，5（6）：383-384.

[5]毛堂芬，朱英.藥用植物頭花蓼的組織培養快速繁殖[J].貴州農業科學，2008，36（5）：16-17.

[6]龍祥友，孫長生.頭花蓼的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2008，44（1）：116.

[7]蔡能，易自力，黃麗芳.安祖花離體培養快速繁殖技術的優化[J].中南林學院學報，2005，25（3）：85-88.

[8]劉用生，李有勇.植物組織培養中活性炭的使用[J].植物生理學通訊，1994，30（3）：214-217. （責編：徐世紅）