銀耳多糖的分子修飾及抗氧化作用的研究

摘要：用POCl3修飾酸水解銀耳多糖所產生的單糖或低聚糖，并通過紅外光譜分析，發現修飾后的產物含有磷酸基團；此外，通過鄰苯三酚自氧化法，結合紫外光譜分析，對修飾前后產物的抗氧化性進行了比較研究，結果表明：在常溫中性條件下，POCl3用量4%～5%，反應時間20～35min，旋轉蒸發溶液只剩20～30mL時，可以使銀耳多糖酸解出的產物充分磷酸化，且磷酸化修飾后產物的抗氧化作用有較明顯的提高。

關鍵詞：銀耳多糖；酸水解；分子修飾；三氯氧磷；抗氧化

中圖分類號 TQ464.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）17-17-03

分子修飾是通過化學、物理學及生物學等手段對化合物分子進行改造，以獲得性能更加優良的結構類似衍生物的方法[1]。分子修飾可改變多糖的空間結構、分子量及取代基種類、數目和位置和生物活性，是多糖構效關系及其藥物研究的有效手段；而構效關系研究結果又指導著多糖分子修飾的方向，可分析多糖結構和活性的關系，為其藥物設計、研究和開發提供理論支持[2-3]。選擇合適的方法對多糖進行分子修飾，可提高其生物活性或降低其毒副作用。為提高多糖活性，多糖分子修飾研究已有很大進展。將多糖或寡糖進行衍生化，如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等，對提高銀耳多糖的水溶性、抗病毒活性或提高免疫力等功能具有良好的作用[4]。

銀耳（Tremella fuciformis Berk），屬菌類植物，素有“菌中之冠”美稱，又名白木耳，是一種高等真菌，具有滋陰潤肺、益氣和血、補腎益精、強心健腦的功能。

銀耳營養成分齊全，賴氨酸含量豐富，碳水化合物含量為65%～78.3%，其中銀耳多糖就占了干重的60%以上，銀耳多糖可提高機體的非特異性和特異性免疫功能，抑制腫瘤發生；銀耳富含疏、磷、鐵、鎂、鉀、鈉及多種元素，對平衡人體代謝十分有益；銀耳含脂類較少，且多為磷脂，因而對高血脂、高血壓及動脈硬化患者有益；銀耳中的粗纖維含量為2.4%～2.75%，對老年便秘患者相當有利；銀耳還含有多種B族維生素，如硫胺素、核黃素等。

近年來，對銀耳的化學成分及藥理活性進行的許多研究和大量的現代藥理證明，多數藥理活性都與銀耳多糖有關。從銀耳子實體中分離到的多糖，相對分子質量1.15×105，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，總糖含量為75.7%，含葡萄糖醛酸14.7%。

通常把較高分子量的多糖，降解成較低的分子量，能顯著提高其活性。選擇適當的降解方法，將多糖降解到適宜的分子量，至關重要。目前降解多糖的方法主要有酸降解、酶降解和超聲波降解等[5]。

本實驗對酸水解后的銀耳單糖或低聚糖用POCl3[6]進行分子修飾，以期改變其分子結構，增加磷酸基功能團，達到提高生物活性的目的。

1 原理和方法

銀耳多糖是活性多糖中的雜多糖，是大分子，可以先將銀耳多糖降解成小分子物質，再進行分子改造。

1.1 銀耳多糖的酸解 酸降解的依據是，酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖降解為低分子片段，控制酸濃度、溫度及時間可獲得不同分子量大小的降解產物。

1.2 銀耳多糖酸解產品磷酸化反應機理 將銀耳多糖降解，得到以甘露糖為主的單糖或者低聚糖，然后用POCl3在適當的pH、用量和反應時間下，充分和銀耳多糖的降解產物發生反應，生成具有磷酸基團的新產物，從而提高降解物質的抗氧化活性，增加其用途。

1.3 銀耳多糖酸解產品的制備 先粉碎銀耳，稱量50g銀耳粉置于900mL的燒杯里；再稱量800mL蒸餾水加入900mL燒杯中，攪拌溶解燒杯內的銀耳粉；接著移取占蒸餾水量20%的濃HCl，混勻攪拌，蓋上保鮮紙；然后立即水浴，設定80℃，2h水浴；取出后，立即用氫氧化納固體中和溶液中的鹽酸至pH為7；然后，將溶液過濾，棄渣取液，放入冰箱保存。

1.4 銀耳多糖酸解產品改性實驗方法 先在溶液中加入適量的活性炭，將液體煮沸，自然冷卻，接著抽濾，使之脫色；取無色透明液體300mL，均分為3個250mL燒杯裝，其中2個加入不同量的POCl3，按液體4%～5%取量，然后加入每個250mL燒杯中，讓其反應20～35min；反應完后，用旋轉蒸發器將每個小燒杯的水分蒸出，將每間隔一段時間蒸出的氯化鈉結晶取出收集起來，另外烘干，取燒杯內的液體繼續蒸，直至得到修飾后較純產品，設定旋轉蒸發的溫度為70℃；將產物制成丸粒完全烘干或半烘干。

1.5 銀耳多糖酸解產品改性前后分子結構的測定方法 采用紅外光譜法，稱取經過充分干燥的三氯氧磷化后的銀耳多糖酸解產物10mg，KBr壓片測定其紅外光譜。從中分析修飾之后和修飾之前產物的基團差異，尋找磷酸基團的存在。

1.6 銀耳多糖酸解產品改性前后活性的測定方法 采用鄰苯三酚自氧化法[7]。取4.5mL 0.1mol/L的Tris—HCl緩沖液，依次加入1.0mL乙二胺四乙酸鈉溶液，1.0mL樣品溶液，2.4mL水，混勻，于25℃水浴反應10min，再加入100μL 9mmol/L鄰苯二酚，加入時計時，混勻，準確反應60min后，加入50μL 12mol/L HCl溶液，終止反應，立即在325nm處測定吸光度值AS。空白管以1.0mL蒸餾水代替1mL樣品，操作方法同樣品管，可測得空白管的吸光度AC。

清除率（%）=（AC—AS）/AC×100

式中：AS——含有待測物的反應液于325nm處的吸光度值；AC——不含有待測物的反應液于325nm處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖酸解方法的研究 本實驗通過在80℃水溫，2h、3h、4h的水浴時間下，將銀耳粉和鹽酸充分反應得到較純的銀耳多糖的分解產物，通過得率的比較，發現在80℃，2h的情況下，銀耳多糖分解產物的得率最高。

2.2 改性方法的研究與反應工藝的確定 通過田龍、劉亞偉[8]對三氯氧磷交聯木薯淀粉研究的啟示，探索實驗方法，對三氯氧磷安全用量進行了分析，最后發現在常溫中性條件下，POCl3添加量占溶液體積的4%～5%，POCl3和銀耳多糖酸降解產物的反應時間20～35min時，產物的三氯氧磷磷酸化的效果較好，得到了修飾后的產物的紅外圖譜，圖形基本重合。在常溫中性，35min的反應時間，4.8mL和5mL三氯氧磷量的條件下，修飾銀耳多糖降解產品，得到了較大量的具有磷酸基團并具有抗氧化活性的產品，當溶液旋轉蒸發最后剩余20～30mL時烘干制得產品，抽樣檢測為同一改性產品。由此，最終確定了改性的方法和工藝流程[8-11]。

另外，本實驗還進行了降解后銀耳單糖或低聚糖溶液pH調節的探索，發現應取pH7的條件。

本實驗在脫色、棄渣取液以及旋轉蒸發的過程中除去較多的雜質，以盡可能得到較純的產品。

2.3 修飾后產物分子結構的測定

2.3.1 紅外光譜圖的測定 上曲線1為銀耳多糖降解產物的紅外光譜圖，下曲線2是銀耳多糖降解產物經過三氯氧磷改性后的紅外光譜圖。1和2比較，相同的功能團是3 721.26cm-1的峰為0-H的吸收峰；3 375.35cm-1的寬峰為0-H和N-H的伸縮振動，2 939.96cm-1為C-H的吸收峰，兩峰是糖類的特征吸收峰；1 606.46cm-1的峰為-CHO的吸收峰；1 416.60cm-1的峰是-COOH的吸收峰，670.49cm-1的吸收峰分別對應圖2的3 727.88、3 367.61、2 946.17cm-1和2 891.91、2 361.19cm-1和2 337.50、1 647.97、1 736.46、671.45cm-1和651.97cm-1的吸收峰[12]。

不同之處是1在852.02cm-1附近（包括789.92cm-1）處都有吸收，說明銀耳多糖降解產物的結構中存在著α型糖苷鍵（即α端基差向異構體），而2則是有磷酸基功能團。通過這2張相似的紅外光譜圖的對比，我們可以發現這2種物質是為改性前后的物質，2比1增加了磷酸基官能團，有些物質的含量有所增減。由于銀耳多糖是一種雜多糖，其酸降解后的產物是由多種單糖組成的[13]，上曲線和下曲線是由多種單糖構成的混合物的修飾前和修飾后的產物，并不是甘露糖的修飾前和修飾后的產物，因此，修飾前的產物具有甘露糖所沒有的功能團。

2.3.2 銀耳多糖酸解產品改性前后的紅外圖譜比較分析 通過曲線1和2的比較，可以從圖1看出，將三氯氧磷化的銀耳多糖酸解產品的紅外光譜和銀耳多糖酸解產品的紅外光譜相比較，發現銀耳多糖酸解產品經三氯磷酸化后，在1 059.62cm-1（v-C-O-C-）處連接上了一個磷酸基團，在1 135.81cm-1和984.06cm-1處組成一個磷酸雙峰；在1 135.81cm-1處，磷酸基團雙峰之一受1 059.62cm-1（v-C-O-C-）處的修飾前的-C-O-C-六元環和右側糖甘鍵基團的拉動發生了少許偏移，磷酸雙峰與圖1原有基團彼此相互作用形成了一個大的吸收峰[14]。其中官能團相似的圖譜之所以沒有重合，可能是由于POCl3的作用。

圖1 修飾前后產品比較

從上面的分析，可以看出，1比2多了個α型糖苷鍵，2則比1多了個磷酸基團。經多次產品紅外分析，圖譜重現性高。

2.4 修飾后產物抗氧化性的測定 本實驗利用O-2清除劑能使鄰苯三酚自氧化[15]產物在325nm處的吸收峰受到抑制這一特點，進行光化學方法測定。

由清除率的計算公式可以計算出修飾前后產物的清除作用的大小，通過比較可以發現4.8mL和5mL三氯氧磷用量的修飾后的產物的抗氧化活性明顯高于修飾前的產物的抗氧化活性。表明修飾成功，具有實用意義。由表1可知，當三氯氧磷的用量為4.8mL時，其清除率比5mL時的要高，可能是因為當三氯氧磷過量時，多余三氯氧磷會繼續與三氯氧磷化后的產物發生反應，使其變為另一種物質，導致一些含有磷酸基團的物質變成沒有磷酸基團的物質，而降低清除率。 （下轉38頁）

表1 修飾前后產物的清除作用比較

[POCL3（mL）＼摩爾濃度（mol/L）＼清除率（%）＼0＼1＼36.36＼4.8＼2＼68.18＼5＼3＼54.54＼]

通過以上的比較分析，可以證明銀耳多糖酸解產品經三氯磷酸化后，增加了磷酸基團，抗氧化活性有了較大的提高[13]。經多次實驗，產品的抗氧化性能均較好。

通過紅外圖譜分析和抗氧化的研究結果分析，可以得出如下結論，使產品具有抗氧化功能的基團是磷酸基團，而并不是其他功能團。

3 結論

3.1 酸降解銀耳多糖的最佳條件 本實驗表明酸降解產生單糖或低聚糖在80℃、2h水浴，鹽酸濃度約15.8%的條件下，銀耳多糖的得率最高。

3.2 銀耳多糖酸降解產品的POCl3化方法 通過實驗可以得出：在常溫中性條件下，POCl3用量4%～5%，反應時間20～35min，旋轉蒸發溶液只剩20～30mL時，得到銀耳多糖酸解出的產品都具有磷酸基團。

3.3 銀耳多糖酸降解產品的抗氧化性 本實驗通過鄰苯三酚自氧化法對磷酸化修飾后產物的抗氧化作用進行了研究，通過清除率的分析發現，修飾后產物的抗氧化作用較修飾前有較明顯的提高。

4 展望

本實驗是通過銀耳多糖降解產品在修飾前和修飾后的基團的變化情況，來判斷出有無修飾上磷酸基團的。如果能夠得到它的完全純化樣品，則可通過質譜分析，得出其分子式，結合紅外光譜解析的計算方法，得出飽和度，從而用于產物結構的判斷。

通過實驗，我們看到銀耳多糖修飾后的產物具有良好的抗氧化性，在生命科學領域具有很好的應用前景，對于藥物、保健品的開發具有積極的意義。

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