玉米ZmbZIP基因植物表達載體的構建

摘要：根據玉米（Zea mays）ZmbZIP的基因序列和植物表達載體pCAMBIA3301的多克隆位點設計帶有限制性內切酶位點的特異性引物，以質粒pGM-T-ZmbZIP為模板PCR擴增ZmbZIP基因片段，雙酶切目的片段及載體，回收后連接，構建該基因的植物表達載體。結果表明，擴增出的ZmbZIP基因片段長度為894 bp。經PCR檢測及測序鑒定，表明植物表達載體構建成功，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：植物表達載體；玉米（Zea mays）；ZmbZIP

中圖分類號：S515；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3175-03

植物堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper， bZIP）蛋白是一個大的轉錄因子家族，它的成員參與調控逆境應答和激素信號轉導[1-3]。堿性亮氨酸拉鏈蛋白包含一個堿性DNA結合區域和一個亮氨酸拉鏈二聚基序。根據植物中bZIP轉錄因子的結構差異，可將bZIP轉錄因子分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亞族共10個亞族。研究表明轉基因植物過表達A族bZIP基因可增強植物對非生物脅迫的忍耐。例如擬南芥AREB1/ABF2是葡萄糖信號傳遞中的重要元件，它的過表達影響擬南芥對多種逆境的忍耐[4，5]，過表達ABF3或AREB2/ABF4可提高轉基因植物對干旱的忍耐能力[6]。在水稻中，OsbZIP72是ABA信號轉導的正調控子，過表達OsbZIP72增強水稻苗期的抗旱能力[7]。

玉米（Zea mays）是重要的糧食和飼料作物，它的生長發育受多種非生物逆境的嚴重影響[8]，因此揭示玉米非生物逆境應答的分子機制是非常重要的。利用模式植物擬南芥研究基因的功能是目前廣泛采用的方法，而構建植物表達載體是在植物體內研究基因功能的前提。因此，本研究構建了玉米ZmbZIP基因的植物表達載體，經菌液PCR和測序鑒定所構建載體的正確性，為進一步轉化模式植物擬南芥研究基因的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、大腸桿菌感受態細胞Top10購于天根生化科技（北京）有限公司。各種限制性內切酶購于寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及序列測定由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司完成。含有ZmbZIP基因cDNA序列的pGM-T-ZmbZIP菌液和植物表達載體pCAMBIA3301菌液由新鄉學院生命科學與技術系園林教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 根據ZmbZIP基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位點設計一對引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位點，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位點，引物序列為：F，5′-ATACCATGGATGGACGAG

CTGCTCCAGAGC-3′； R，5′-TAAAGATCTTCACCA

GGGGGCCGTCAACGT-3′ （下劃線分別表示NcoⅠ 和Bgl Ⅱ酶切位點）。按照TIANGEN質粒小提試劑盒說明書提取pGM-T-ZmbZIP質粒。以pGM-T-ZmbZIP質粒為模板進行PCR擴增。PCR反應體系包括質粒（50 ng/μL） 1 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2 μL、引物（10 μmol/L） 2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結果，采用凝膠回收試劑盒回收長度正確的擴增片段產物。

1.2.2 植物表達載體的構建 按TaKaRa限制性內切酶使用說明書推薦體系，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切ZmbZIP回收產物和植物表達載體pCAMBIA3301，酶切后經瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，凝膠回收試劑盒回收酶切產物，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接目的片段到植物表達載體中。連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，涂于含有卡那霉素的LB固體培養基上，過夜培養后挑取陽性克隆，經含有卡那霉素的液體培養基振蕩培養12 h后，菌液PCR檢測是否有插入片段，陽性克隆送北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。

2 結果與分析

2.1 ZmbZIP基因片段的PCR擴增

以含有ZmbZIP基因cDNA序列的質粒pGM-T-ZmbZIP為模板，PCR擴增帶有Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位點的產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，擴增產物大小為894 bp，與預期大小一致（圖1），且產物條帶清晰明亮，滿足后續實驗的要求。

2.2 植物表達載體的構建及鑒定

用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切目的片段和載體后，連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，對重組質粒pCAMBIA3301-ZmbZIP進行菌液PCR鑒定，結果表明，能夠從轉化pCAMBIA3301-ZmbZIP的大腸桿菌菌液中擴增出大小為894 bp的目的片段，陽性菌液送北京鼎國昌盛公司測序，測序比對發現，插入序列與ZmbZIP序列完全一致，表明pCAMBIA3301-ZmbZIP載體構建成功（圖2）。

3 討論

玉米中存在170個堿性亮氨酸拉鏈蛋白，但是僅有很少的玉米堿性亮氨酸拉鏈蛋白的功能被研究[9，10]。本研究成功構建了玉米ZmbZIP基因的植物表達載體并采用菌液PCR結合測序的方法對構建的植物表達載體進行了鑒定，與酶切鑒定相比，測序鑒定能夠保證插入片段序列的正確性，只有未發生堿基突變的序列才能在植物體內編碼正確的堿性亮氨酸拉鏈蛋白，行使其生物學功能。本研究通過測序驗證了插入的ZmbZIP序列與原始序列一致，為進一步轉化擬南芥揭示ZmbZIP基因的功能奠定了實驗基礎。

參考文獻：

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