產甘露聚糖酶解淀粉芽孢桿菌的篩選鑒定及產酶條件優化

摘要：從海底淤泥中篩選出一株產高活性β-甘露聚糖酶的菌株，經16S rDNA序列分析表明，該序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA序列同源性為100%，將該菌株命名為Bacillus amyloliquefaciens T27。對該菌株產酶條件進行了優化，以魔芋粉為碳源，酵母粉為氮源，裝液量為50 mL，250 r/min、37 ℃培養24 h，發酵液中粗酶活力能達到98.0 U/mL。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；甘露聚糖；甘露聚糖酶

中圖分類號：TQ925+.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3105-04

目前，在全球能源危機、糧食缺乏及環境保護越發重要的情況下，甘露聚糖酶在食品、造紙、印染、紡織等許多方面都具有重要作用[1-4]。β-甘露聚糖酶能特異性水解甘露糖類半纖維素，產生大量甘露寡糖和少量甘露糖[5]。該酶廣泛存在于植物、動物、微生物中[6]，其中微生物來源的甘露聚糖酶具有易于大規模生產、來源穩定、生產成本低等特點，因此，尋找發掘能夠產甘露聚糖酶的微生物資源備受人們關注。由于工業生產中要求所使用的甘露聚糖酶具有較強的穩定性、耐熱性及耐酸堿等特性，普通土壤環境下微生物產生的酶很難滿足這一要求。海洋尤其深海環境特殊，包括了高壓、低溫、高鹽、極端pH等，這一特殊環境中蘊藏著大量的稀有微生物資源。由于深海微生物產生的酶往往具有耐高溫、耐高壓和耐鹽堿等特點[7]，在一些較為苛刻的工業環境中表現出極大的應用價值。因此，從海洋微生物中發掘新的酶資源受到越來越多的關注。

本研究從海底淤泥中篩選到一株產甘露聚糖酶的海洋細菌，經分子生物學鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并初步研究了該菌株的最佳產酶條件，為進一步利用該海洋菌株生產甘露聚糖酶奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑 海底淤泥樣品取自廈門深海；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司；槐豆膠、低熔點瓊脂、蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養基

1）選擇培養基。魔芋粉20.0 g，酵母膏20.0 g，NaCl 6.0 g， MgSO4·7H2O 1.0 g， KH2PO4 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.5。

2）種子培養基（LB培養基）。蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 產甘露聚糖酶菌株的篩選與鑒定 取約2 g泥樣加入到100 mL蒸餾水中浸泡2 h左右， 取適量泥樣懸液稀釋， 不同濃度梯度分別涂布在固體選擇培養基上， 37 ℃倒置培養2 d后，用0.1%剛果紅染色10 min后棄去染液，用蒸餾水洗脫，選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株[8]。將篩選出的甘露聚糖酶高產菌株在LB固體培養基上劃線培養，挑取單菌落于LB液體培養基中，28 ℃培養12～16 h，提取細菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物（fP1：5′-AGAGTTTGAT

CCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG

ACTT-3′），PCR擴增所篩選出菌株的16S rDNA， PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。將測序（測序交由華大基因公司完成）后的序列通過與GenBank中登錄的基因序列進行BLAST比對，確定篩選出的菌株的種屬。

1.2.2 甘露聚糖酶的活力測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量[9]。取10 μL甘露聚糖酶加入到90 μL 0.5%槐豆膠底物，55 ℃反應30 min，然后加入100 μL DNS終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至1 mL，再取200 μL加至96孔板中，測定OD540 nm。

1.2.3 產甘露聚糖酶菌株產酶條件的優化 ①培養時間對產酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL液體選擇培養基，接種2%的種子培養液，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養12、24、48 h取樣測定酶活。②培養溫度對產酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL液體選擇培養基，接種2%的種子培養液，置于28、37 ℃的搖床，轉速為200 r/min培養24 h后取樣測定酶活。③碳源對產酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL以魔芋粉和槐豆膠為不同碳源的液體選擇培養基，分別接種2%的種子培養液，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活。④氮源對產酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4為不同氮源的培養基，分別接種2%的種子培養液，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活。⑤培養基裝液量對產酶的影響。250 mL的三角瓶中裝入25、50、75、100 mL的液體選擇培養基，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活。

2 結果與分析

2.1 產甘露聚糖酶菌株的篩選

利用選擇培養基從海底淤泥樣品中篩選高產甘露聚糖酶的菌株。結果發現一株菌落形態光滑的海洋細菌，出現較大、較清晰的水解圈（圖1）。

2.2 產甘露聚糖酶菌株的鑒定

LB液體培養基培養細菌過夜后，抽提細菌的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用16S rRNA通用引物PCR擴增16S rDNA，結果見圖2。由圖2可知，擴增的16S rRNA條帶清晰、特異，將回收的16S rDNA片段送至華大基因公司測序。與GenBank中登錄的基因序列進行BLAST比對，結果發現與解淀粉芽孢桿菌的16S rRNA同源性為100%。根據基于近緣種的16S rDNA序列構建的系統發育樹，該菌株與DSM11031和B-23049（T）形成一個分支，有100的自展值（圖3）。將該菌株命名為Bacillus amyloliquefaciens T27。

2.3 培養時間對產酶的影響

利用以魔芋粉作為選擇培養基的惟一碳源，接種2%的種子培養液，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養12、24、36、48 h后取樣測定酶活，研究培養時間對產酶的影響（圖4）。由圖4可知，24 h內甘露聚糖酶活力隨培養時間的延長呈現上升趨勢，并在24 h達到最高點；24 h后甘露聚糖酶活力緩慢下降。這與菌株的生長速率以及酶的表達量、失活速率是基本一致的。

2.4 培養溫度對產酶的影響

利用以魔芋粉作為選擇培養基的惟一碳源，接種2%的種子培養液，置于28、37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活，研究培養溫度對產酶的影響（圖5）。由圖5可知，37 ℃培養條件下甘露糖聚酶活力比28 ℃時高出大約20%，37 ℃培養溫度對菌株產酶更有利。

2.5 碳源對產酶的影響

天然菌株通常為誘導產酶，不同的碳源由于其化學結構的不同，對菌株的誘導產酶也不同。250 mL三角瓶分別裝入50 mL以魔芋粉和槐豆膠為不同碳源的選擇培養基，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活（表1）。從表1中可以看出，菌株在以魔芋粉作為惟一碳源時，產酶效果明顯優于槐豆膠。

2.6 氮源對產酶的影響

氮源對發酵產酶有重要影響。250 mL三角瓶分別裝入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4為不同氮源的培養基，分別接種2%的種子培養液，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活（表2）。從表2中可以看出，菌株在以酵母粉作為惟一氮源時，產酶效果明顯優于其他氮源。

2.7 培養基裝液量對產酶的影響

培養基裝液量直接影響搖瓶發酵中細菌生長的氧氣量，從而影響發酵過程中菌株的生長和產酶能力。250 mL的三角瓶中裝入25、50、75、100 mL的液體培養基，置于37 ℃的搖床，轉速為250 r/min培養24 h后取樣測定酶活（圖6），由圖6可知，50 mL培養基裝液量產酶活性最高，達到98.0 U/mL，培養基中氧氣含量直接影響解淀粉芽孢桿菌T27的產酶量。

3 小結與討論

甘露聚糖酶在生物能源、飼料和食品工業中有著廣泛的應用，甘露聚糖酶的發酵優化和重組表達能夠為工業生產這類酶提供參考。通過透明圈法篩選得到了能夠水解甘露聚糖的海洋細菌菌株，其中解淀粉芽孢桿菌T27在甘露聚糖平板上能夠顯示出相對較大的水解圈，而且相對于其他海洋細菌的水解圈，解淀粉芽孢桿T27水解圈透明度較高。

解淀粉芽孢桿菌T27在以魔芋粉為碳源，酵母粉為氮源，蛋白胨為蛋白水解物，（NH4）2SO4為無機氮源的培養基上產酶效果最好。魔芋粉的主要成分為葡甘露聚糖，而葡甘露聚糖是天然的甘露聚糖以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結而成的線狀多糖，加上部分葡萄糖殘基形成的[10]。槐豆膠主要為半乳甘露聚糖，主要是以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結而成的線狀多糖，加上部分修飾的半乳糖殘基形成[11]。這表明解淀粉芽孢桿菌T27甘露聚糖酶在葡甘露聚糖的誘導下表達好，可能與甘露聚糖酶的水解特性和甘露聚糖酶基因的啟動子的特異性有關。不同的氮源，其氮元素的配比和含量上都有明顯的區別，這在甘露聚糖的表達誘導上能發揮主要作用。解淀粉芽孢桿菌T27培養24 h產酶活性最高，這與芽孢桿菌的生長特性以及甘露聚糖酶的表達特性有關。培養基的裝液量主要影響容氧量。當裝液量過高時，容氧量過低，會影響菌體生長，從而影響產酶；當裝液量過低時，搖床轉動時會產生過大的機械剪切力，使菌體難以與營養成分粘附，導致產酶降低。

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