虹彩病毒和柱狀黃桿菌混合感染大鯢的診治

摘要：2012年7月，貴州省某大鯢養殖場發生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、內臟器官出現充血、出血為特征的疾病，經過臨床癥狀觀察、病理剖檢及實驗室診斷，診斷為虹彩病毒（Iridovirus）和柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通過采取綜合有效的防治措施，大鯢疫情得到有效控制。

關鍵詞：大鯢（Andrias davidianus）；虹彩病毒（Iridovirus）；柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）；混合感染

中圖分類號：S947.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3102-03

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，其經濟價值高，具有廣泛開發利用的前景。近年來，人工養殖大鯢中不斷發生各種疾病，給養殖戶造成慘重的經濟損失。2012年7月，貴州省某大鯢養殖場發生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、內臟器官出現充血、出血為特征的疾病，經過臨床癥狀觀察、病理剖檢及實驗室診斷，診斷為虹彩病毒（Iridovirus）和柱狀黃桿菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通過采取有效的防治措施，大鯢疫情得到有效控制，現將診治情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 貴州省某大鯢養殖場發病大鯢，體重150～300 g，體長30.0～35.0 cm。

1.1.2 試劑 生化鑒定管和藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；Goldview、Tris、EDTA、DNA Marker、Taq DNA聚合酶及dNTPs等購自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀觀察及病理剖檢 觀察大鯢臨床癥狀并對病死大鯢進行病理解剖，觀察大鯢組織器官病變情況。

1.2.2 細菌生化鑒定與藥敏試驗 采用無菌操作剖取患病大鯢的肝臟組織，用接種環接種在普通瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養18～24 h，觀察是否有細菌生長。若分離出細菌，將進行細菌的生化鑒定與藥敏特性的測定。藥敏試驗按常規藥敏紙片法測定頭孢噻吩、頭孢拉定、慶大霉素、氟哌酸、頭孢三嗪、強力霉素、頭孢唑啉、卡那霉素、四環素、青霉素、氨芐青霉素、紅霉素、潔霉素、多粘菌素B、痢特靈、復方新諾明、利福平、鏈霉素等抗菌素對分離菌株的抗藥譜，測定抑菌圈直徑。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析 用TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒提取病死大鯢基因組DNA。采用細菌16S rRNA基因通用引物，16S rRNA-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rRNA-R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用25 μL反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經純化后，送至寶生物（大連）工程有限公司進行序列測定。

1.2.4 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測 參照文獻[1]設計合成1對特異性擴增虹彩病毒主要核衣殼蛋白（MCP）基因的引物，PCR擴增檢測虹彩病毒MCP基因，預期擴增片段大小為510 bp。MCP-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′，MCP-R：5′-GTCTC

TGGAGAAGAAGAA-3′。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及病理剖檢結果

大鯢因更換餌料而突然發病。發病初期大鯢行動緩慢，攝食量減少，5～7 d后出現腹部腫脹，前、后肢嚴重腫脹、潰爛，口腔黏膜彌漫性出血。用青霉素和慶大霉素浸泡，部分進行肌肉注射治療無效，并在治療過程中陸續死亡，發病大鯢死亡率高達90%。對病死大鯢進行病理剖檢，下頜與腹部肌肉組織出現充血，腹腔內有大量淡黃色的積水，肝臟腫大，有淤血呈花斑狀，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大，腸道充血出血，腸壁內充滿了淡黃色的漿液（圖1）。

2.2 細菌的分離培養

采用無菌操作取患病大鯢的肝臟組織，用接種環接種在普通瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養18～24 h后長出1.0～2.5 mm大小的菌落，其表面光滑、濕潤、有光澤、邊緣整齊、呈黃色。經革蘭氏染色鏡檢發現該菌為革蘭氏陰性，其兩端鈍圓、散在或個別成雙排列、無芽孢。

2.3 生化鑒定及藥敏試驗結果

將分離得到的菌株進行生化鑒定，該菌能分解七葉苷，氧化酶陽性，不能分解甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖、肌醇、乳糖，不產生靛基質，不產生硫化氫，不分解尿素，硝酸鹽還原陰性，鳥氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、水楊素、賴氨酸脫羧酶陰性，MR試驗和VP試驗均為陰性。

藥敏試驗結果表明，該菌株對頭孢噻吩、頭孢拉定高度敏感，對慶大霉素、氟哌酸、頭孢三嗪、強力霉素、頭孢唑啉、卡那霉素、四環素、青霉素、氨芐青霉素、紅霉素、潔霉素、多粘菌素B、痢特靈、復方新諾明、利福平、鏈霉素不敏感。

2.4 16S rRNA基因序列分析

將分離菌株的16S rRNA序列與GenBank中柱狀黃桿菌的16S rRNA基因進行比對，核苷酸同源性為99%以上，結合細菌生化鑒定及藥敏試驗結果，表明分離到的病原菌為柱狀黃桿菌。

2.5 虹彩病毒的PCR檢測

從3只患病大鯢肝組織中均擴增到預期大小約510 bp的DNA片段（圖2）。測序后使用DNAStar軟件進行多序列比對。結果發現該序列和虹彩病毒MCP基因有96%～99%的同源性，結果表明大鯢感染了虹彩病毒。

3 防治措施

綜合流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室診斷結果，該養殖場發生的以體表和四肢多處潰爛、內臟器官出現充血、出血為特征的大鯢疾病，診斷為虹彩病毒和柱狀黃桿菌混合感染。確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行隔離，對未患病大鯢應用黃芪多糖、電解多維、葡萄糖進行浸泡，連用7 d。對養殖場、養殖水體及養殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。同時進行虹彩病毒抽樣PCR檢測，嚴格控制進出人員數量，工作人員在進入養殖場之前必須通過消毒池和紫外燈通道進行消毒。對患病大鯢采用水產用20 mg/kg頭孢拉定進行腹腔注射，同時應用水產用高效維生素C和維生素E進行浸泡，每天1次，連用7 d。20 d后發病的大鯢部分開始攝食，死亡數量明顯減少，疫情得到了遏制。

4 小結與討論

隨著大鯢養殖規模化和集約化發展，由于缺乏對引種和餌料消毒的重視。近些年發生的大鯢疾病，大多為多種病菌并發、繼發或混合感染，使大鯢疾病的診斷和防治的難度增加。研究者相繼報道了熒光假單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、弗式檸檬酸桿菌、黃桿菌引起大鯢死亡的病例，且存在幾種菌混合感染[1-4]。本研究中分離的菌株在生化鑒定和藥敏試驗上與黃錦爐等[5]、劉禮輝等[6]等分離的柱狀黃桿菌有所差異，出現這些差異可能是由于地區、氣候、水質條件及實驗室培養條件等方面的不同而產生的，加之細菌對抗生素類藥物的耐藥性具有變異性。因此，本研究將生理生化特性測定與16S rRNA序列分析鑒定相結合，使鑒定方法更科學，鑒定結果更可靠、更準確。同時，本研究表明臨床用藥應根據藥敏試驗結果合理選擇抗菌藥物進行治療，以減少耐藥菌株的產生。

本研究中檢測到的虹彩病毒是水產養殖動物重要的病毒性病原[7]。耿毅等[8]報道了蛙病毒感染可導致養殖大鯢大規模死亡。江育林等[9]、高正勇等[10]從患病大鯢體內分離到虹彩病毒，并對該病毒的理化及生物學特性進行了研究。針對目前規模化大鯢養殖場疫病的復雜局面，應樹立保健和預防觀念，采取合理的消毒程序，建立完善的預防方案，加強對餌料魚的檢測與消毒。同時對患病大鯢制定科學的用藥方案，正確配伍，協同用藥，辨證施治，綜合治療。

參考文獻：

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[10] 高正勇，曾令兵，肖漢兵，等.大鯢虹彩病毒理化及生物學特性研究[J].淡水漁業，2012，42（5）：17-21.