一株產黑色素海洋細菌的初步鑒定

摘要：從波羅的海近海海水中分離出1株產黑色素的海洋細菌。該菌株可利用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等碳源，H2S、V.P. 及明膠液化試驗呈陰性，酶觸試驗呈陽性，為革蘭氏陰性細菌，經16S rDNA初步鑒定后命名為Rheinheimera sp. 09BSZB-9，并對其產生的黑色素作了初步研究。

關鍵詞：海洋細菌；黑色素；鑒定；Rheinheimera

中圖分類號：Q93-3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3046-03

黑色素廣泛存在于自然界生物體內，是一類由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素[1]。它是醫藥、農業及化妝品行業的一種生產原料。從動植物體內提取黑色素的生產過程繁瑣、成本高，而微生物所產的黑色素一般是由胞內酶催化形成的氨基酸的衍生物。產黑色素的微生物資源豐富，生產工藝簡單易行，產品無毒害，穩定性好。因此研究微生物發酵產生黑色素具有很大的優勢[2-4]。人們對陸境產黑色素的微生物研究較多，對海洋中產黑色素的微生物報道較少。本試驗研究從波羅的海分離的一株著色菌科細菌，該菌具有產黑色素的能力，在生理生化特征及16S rDNA序列等方面與Rheinheimera chironomi相近，以期為海洋微生物黑色素研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 菌株ZB-9由本實驗室的劉斌分離于波羅的海（E12.687 5°，N54.429 8°）海水。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA Marker、dNTPs、Taq酶等購自Takara公司；PCR純化試劑盒購自Omega公司；Biometre公司PCR擴增儀（T3）；Eppendorf公司微型臺式離心機；日本JEOL公司JEM-1230透射式電鏡；德國Bruker公司TENSOR 27型紅外光譜儀。

1.1.3 培養基 2216E細菌培養基、Tyr發酵培養基[5]、酪素培養基[6]、LB培養基均按人工海水和蒸餾水各半配制，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指標的測定 參照文獻[7、8]對菌株ZB-9進行生理生化實驗測定。

1.2.2 形態特征觀察及發酵 將菌株ZB-9接種于LB培養基，24 ℃培養2 d，利用顯微鏡及透射電鏡觀察菌體形態并拍照。將菌株涂布于221 6E平板，24 ℃活化2 d，轉接試管培養2 d，再將菌液接種于1.1.3的4種液體培養基中，24 ℃，150 r/min搖瓶培養至菌液呈黑色。

1.2.3 16S rDNA序列分析 細菌基因組DNA的提取參照文獻[9]的方法。PCR擴增的通用引物：27F，1492R；PCR反應條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒純化后，送交上海博亞生物技術有限公司完成序列測定。所測得的序列提交至GenBank，獲得登錄號，并與數據庫EzTaxon Server Version 2.1中已有序列進行BLAST比對分析，選取同源性較高的16S rDNA序列作為參比對象，運用DNAMAN進行多重序列分析，通過MEGA 4.0軟件，采用鄰接法構建系統進化樹[10]。

1.2.4 黑色素的提取與鑒定 參照文獻[11、12]方法提取黑色素；取少量提取的黑色素純品，用溴化鉀壓片法測其紅外吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 菌株的生理生化特征

挑新鮮菌落于3%的KOH中出現拉絲現象，為革蘭氏陰性菌，H2S、V. P.及明膠液化試驗呈陰性，酶觸試驗呈陽性，銅離子（0.1 g/L）會抑制其生長。對麥芽糖、蔗糖及纖維二糖利用較好，不能利用淀粉、檸檬酸（表1）。菌株在酪氨酸培養基上適宜生長溫度為4～40 ℃。菌落較小，濕潤、光滑、圓形突起、邊緣整齊，菌體之間粘連成團，易挑取整個菌落，呈黑色（起初白色，產黑色素后呈黑色，圖1）。

2.2 菌株的形態及發酵特性

菌體寬0.8～1.4 μm，長0.8～2.4 μm，電鏡下菌體周圍有分泌物，單端鞭毛（圖2）。菌株在4種液體培養基中均產生黑色素，其中較好的是Tyr發酵培養基。

2.3 菌株的鑒定結果

該菌株的16S rDNA序列長度為1 358 bp，GenBank登錄號為HM566014。將該序列與數據庫EzTaxon Server Version 2.1相關序列進行BLAST分析，選取同源性高的9株菌的16S rDNA序列構建系統發育樹，如圖3所示，該菌株與R. chironomi處于進化樹的同一分支，同源性99.853%，與R. pacifica的同源性97.035%。除產黑色素同R. chironomi有別外，其他生理生化及形態特征差別不大。

2.4 黑色素的鑒定結果

紅外光譜分析表明，樣品在3 300～3 400 cm-1、1 640 cm-1附近有強吸收峰，在1 382 cm-1、1 450～1 600 cm-1、2 900 cm-1附近有弱吸收峰；1 238 cm-1附近有中強吸收峰（圖4）。據文獻報道3 300 cm-1處的吸收峰是因為-OH、-NH2的伸展振動引起，1 643 cm-1處吸收峰主要是C=C、-COO-、C=O伸展振動引起，與文獻[13]的紅外光譜圖相似，說明其主要功能團基本一致。

3 討論

在菌株的培養特征、生理生化特征和細胞特征的基礎上，結合16S rDNA序列分析結果，菌株ZB-9與R. chironomi[14]比較相似，而與R. pacifica差別很大（表1）。暫命名為Rheinheimera sp. 09BSZB-9。

該研究首次發現色菌科細菌可產黑色素，在酪氨酸存在的條件下黑色素產量較好。黑色素越來越受到人們的青睞，與從動植物中提取的方式相比，利用微生物發酵生產黑色素具有快速、簡便、易提取等特點，且細菌、放線菌產生的黑色素可分泌到胞外，無需破碎細胞，便于提取。下一步將對ZB-9產黑色素的發酵條件做細化研究，為其開發應用打下基礎。

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