非典型分支桿菌的分類鑒定方法研究進展

摘要：非典型分支桿菌與結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復合群、麻風分支桿菌（M. leprae）同屬于分支桿菌屬（Mycobacterium）。隨著對結核桿菌的深入研究，非典型分支桿菌也逐漸引起了人們的關注。為了對非典型分支桿菌進行系統的了解和分類鑒定，就國內外常用的分類鑒定方法進行了綜述。

關鍵詞：非典型分支桿菌；結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；分類；鑒定

中圖分類號：R378.91；C34 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-2977-03

非典型分支桿菌是指除了結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復合群和麻風分支桿菌（M. leprae）之外的其他分支桿菌，包括偶發分支桿菌（M. fortuitum）、鳥分支桿菌（M. avium）、堪薩斯分支桿菌（M. kanasii）等30多種分支桿菌。非典型分支桿菌生長緩慢，具有一定的致病性，臨床表征與結核分支桿菌相似，容易造成誤診。因此，對非典型分支桿菌的分類鑒定就顯得尤為重要。本研究擬對臨床中常用的分類鑒定方法進行綜述，旨在為更深入的研究提供參考。

1 傳統分類方法

培養分支桿菌常用的培養基有固體培養基，如改良羅氏培養基、匡氏瓊脂PNB培養基和Middle brook 7H10、7H11瓊脂培養基，在固體培養基中通過觀察菌落形態和生長情況鑒定分支桿菌；液體培養基包括Sauton培養基和Middle brook 7H9等，細菌充分接觸營養物質時易大量獲得細菌，但缺點是易污染，需先進行涂片處理才能觀察菌落形態。2008年Wang等[1]檢查一位患者咽喉部病變時，經過組織切片和涂片后觀察到侵染細菌與鳥分支桿菌復合群相一致。2010年Sajduda等[2]應用PRA（PCR restriction analysis）和傳統分離方法鑒定64株分支桿菌，結果表明PRA優于傳統方法和特殊DNA測序方法。Guarin等[3]在研究區分龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復合群時，對傳統分類方法、高效液相色譜分析方法和實時PCR方法進行了比較試驗。由于傳統鑒定方法耗時長、對操作要求十分嚴格、培養物易受外界環境污染，所以在實際工作中不易被采用。高效液相色譜法雖然可被廣泛應用于非結核性分支桿菌的分類鑒定，但是該方法不能將龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復合群里的成員區分開。相對前兩種方法，采用實時PCR方法更為快捷省時、操作簡單，大大提高了工作效率。

2 全自動分支桿菌快速生長培養儀檢測方法

20世紀70年代末，BD公司研制的BACTEC 460-TB成為全球第一臺專業的全自動分支桿菌培養鑒定儀，該系統培養基以Middle brook 7H12為基礎，在培養基中加入標記14C的棕櫚酸，因此也稱為放射性同位素液體培養法。張敦熔[4]在Middle brook系列培養基中加入NAP及其他選擇性抑制劑，將培養出來的細菌經過分析儀檢測能夠快速鑒定出結核與非結核分支桿菌，該技術解決了傳統培養方法耗時費力的缺點，使細菌快速培養成為現實。Kontos等[5]應用全自動分支桿菌快速生長培養儀BACTEC MGIT960和PCR-RFLP相結合的方法檢測從臨床樣本中分離到的分支桿菌，檢測結果與常規生化試驗檢測結果相一致，但在檢測的敏感性和時間上明顯優于常規檢測方法。

3 噬菌體分析方法

胡忠義等[6]應用分支桿菌噬菌體D29采用噬菌體生物擴增法鑒定結核和非結核分支桿菌，經過37 ℃感染1 h，結果結核分支桿菌生物擴增檢測為陽性，非結核分支桿菌檢測為陰性。呂斌等[7]應用基因工程技術構建可表達熒光素酶的結核分支桿菌重組噬菌體。由于噬菌體具有特異性強、靈敏度高的特點，且不同的分支桿菌發光水平不同，因此重組噬菌體分析方法是一種鑒別結核和非結核分支桿菌的有效方法。

4 聚合酶鏈式反應技術

聚合酶鏈式反應（PCR）技術已廣泛應用于分子生物學領域。由于PCR技術具有快速、靈敏度高、操作簡單等優點，在分支桿菌鑒定方面也是一種常用的鑒定方法。李國利等[8]利用雙重PCR技術尋找結核與非結核分支桿菌之間的特異性條帶，旨在快速鑒定結核與非結核分支桿菌。侯瑞生等[9]利用多重PCR體系將臨床病例標本和標準菌株進行檢測比較，結果顯示對病例標本和標準菌株的檢測靈敏度達到94.6%，特異性達到100.0%。吳雪瓊等[10]利用不同細菌的單鏈DNA構象不同的特點，建立了PCR-SSCP單鏈構象多態性聚合酶鏈式反應體系，用以區別結核與非結核分支桿菌。Yamada-Noda等[11]根據dnaJ基因建立PCR反應體系。結果表明，在54株模式株中，dnaJ的同源性為80.4%，低于16S rRNA的96.6%、rpoB的91.3%和hsp65的91.1%，dnaJ PCR技術可以作為一種新的方法區別結核與非結核分支桿菌，利用通用引物建立PCR反應體系并進行測序分析可以準確地鑒定出多種分支桿菌。Selvaraju等[12]利用hsp65基因限制性分析龜亞科分支桿菌復合群，該方法根據hsp65基因的多態性可以將復合群里的每種菌株分別鑒定出來。Martin等[13]利用生化方法、hsp65基因PCR-RFLP和PRA技術鑒定從人類臨床標本中分離出分支桿菌，結果表明，相對一般生化方法，PRA技術操作簡單、方便、快捷，是一種可靠的鑒定方法。Sajduda等[14]應用PRA配合毛細管電泳法，分離鑒定出27株堪薩斯分支桿菌和29株龜分支桿菌-膿腫分支桿菌復合群。結果表明，PRA技術配合毛細管電泳法能夠快速準確地鑒定分支桿菌。

5 核酸探針技術

核酸探針技術是將一段帶有標記的核酸片段在一定的溫度、pH等條件下與核酸互補鏈通過氫鍵結合形成穩定的復合物結構，經過顯影技術顯示結果。李國利等[15]以16 S-23 S rDNA內轉錄間隔區序列為靶基因設計核酸探針，利用PCR-反向雜交技術可以將分支桿菌鑒定到種的水平。還可以利用生物素標記臨床樣本的核酸制成探針，與標準菌株DNA雜交，以大腸桿菌作為陰性對照，可以快速將細菌鑒定到種。梁建琴等[16]運用16 S rRNA-寡核苷酸探針反向雜交陣列法檢測臨床樣本中的分支桿菌，結果顯示寡核苷酸探針特異性強、檢測靈敏度高，可作為鑒定臨床分支桿菌菌種的方法。Tobler等[17]采用hsp65實時PCR和DNA微陣列法快速檢測37株分支桿菌，結果鑒定出34株分支桿菌，與16 S rRNA的測序結果一致。Sun-Joon等[18]采用rpoB PCR-反向DNA寡核苷酸特異性探針鑒定分支桿菌，從504株臨床樣本中分離出48株鳥分支桿菌和60株胞內分支桿菌，其他菌株經鑒定分別為366株結核分支桿菌、9株膿腫分支桿菌、8株偶發分支桿菌、2株淺黃分支桿菌和11株外來分支桿菌。該方法快速、準確、敏感度高、特異性強。

6 細胞脂肪酸成分分析方法

將細菌制成凍干粉后，將粉末經過甲酯化，供氣相色譜儀或色譜/質譜儀（GC/MS）分析，由于非結核分支桿菌含有結核分支桿菌所沒有的特征脂肪酸，經過儀器分析鑒定出異十六烷酸、異十七烷酸、十六烯酸、十八烯酸、十八二烯酸等成分，進一步探明了其組分的化學本質，鑒定出戈登分支桿菌（M. gordonae）無結核分支桿菌硬脂酸，牛型結核分支桿菌（M. bovis）沒有α-甲基十八烯酸，為分支桿菌脂肪酸分析提供了科學依據。美國MIDI公司生產的全細胞脂肪酸分析系統，通過使用安捷倫的氣相色譜、MIDI微生物數據庫和MIDI圖譜識別軟件來鑒定每個菌株，對菌株的鑒定表現得更為客觀，減少了人為因素造成的錯誤，并能鑒定到種的水平。

7 氣相色譜法和薄層層析法

將氣相色譜法與傳統生物學鑒定方法進行對比，結果兩種方法鑒定出的分支桿菌94.0%相符合。用氣相色譜法和薄層層析法相結合將28種標準菌株中85.0%的菌株區分開來。另外，Rebuffo-Scheer等[19]利用傅里葉變換紅外顯微分光鏡檢查法鑒別分支桿菌。利用紅外線光譜得到的線性反應建立標準化模式，可以根據光譜分析快速檢測臨床標本的未知分支桿菌。

8 結語

臨床中用于鑒定非典型分支桿菌的方法很多，以上介紹的是國內外較為常用的幾種分類鑒定方法。每種方法都有其優缺點，因此，往往根據實際需要采用幾種方法聯合應用，如利用傳統培養方法進行培養，再配合PCR技術、核酸探針技術進行鑒定，或者利用PCR技術與反向核酸探針技術相結合的方法，能夠更加系統、全面地對非典型分支桿菌進行分類鑒定，對臨床研究非典型分支桿菌有很大的幫助。

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