不同牛種SOCS6基因5′調控區多態性分析

摘要：為篩選SOCS6基因啟動子區域單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）并研究其對啟動子功能元件的影響，選擇品種差異較大的貴州荷斯坦奶牛和務川黑牛構建DNA池，直接測序篩選SNP位點。結果表明，SOCS6基因5′調控區存在4個SNP位點，分別為T-513G、C-401T、A-332G和T-180G。生物信息學軟件預測得到SOCS6基因核心啟動子區和CpG島，SNP位點導致附近部分轉錄因子結合位點消失和新位點產生。多態性位點對轉錄因子結合位點有顯著影響，但并不改變CpG島大小。

關鍵詞：細胞因子信號傳導抑制子（Suppressor of cytokine signalling，SOCS）；單核苷酸多態性（SNP）；啟動子；貴州荷斯坦奶牛；務川黑牛

中圖分類號：S823.8；Q756 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3991-04

細胞因子誘導SH2蛋白（Cytokine inducible SH2 protein，CIS）和細胞因子信號傳導抑制子（Suppressor of cytokine signalling， SOCS）是細胞因子信號轉導抑制蛋白的家族成員，對GH在內的細胞因子或生長因子通路起負調控作用[1-3]。SOCS6蛋白含有SH2（Src-homology 2）結構域、較長的N端結構域和C端SOCS box[4]，和其他SOCS蛋白不同，SOCS6蛋白N端結構域具有300個氨基酸結構[5]，SOCS6蛋白作為E3泛素連接酶，利用其SH2結構域與c-KIT蛋白pY568位點結合，與c-KIT作用抑制干細胞因子誘導細胞擴增[6]。SOCS6蛋白可能不與細胞因子信號途徑中的細胞因子相互作用，不抑制細胞因子受體信號通路，但會減少STAT3蛋白水平[7]，而STAT3可作為轉錄因子調控與生長相關基因的表達。SOCS6轉基因小鼠細胞因子信號通路和造血系統正常，但葡萄糖代謝水平提高，并出現生長遲緩現象[8]。

豬和人的SOCS6蛋白有92.3%的氨基酸同源性，SOCS6蛋白在豬多種組織中有相似表達，大腸、小腸內表達量較高[9]。對牛的SOCS6基因研究極少，基因啟動子變異通過改變RNA聚合酶和轉錄因子與調控序列的結合來影響基因表達水平。本研究為篩選SOCS6基因啟動子區單核苷酸的多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNP），研究其對啟動子功能元件的影響，選擇生長性能差異明顯的務川黑牛和貴州荷斯坦奶牛構建DNA池，測序后用DNAStar軟件進行序列拼接、校正，BLAST比對分析SOCS6基因多態性，將牛SOCS6基因啟動子區篩選到的SNP位點與NCBI中SNP數據庫進行比較，運用不同生物信息學軟件預測核心啟動子區和CpG島，分析SNP位點對轉錄因子結合位點的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州荷斯坦奶牛54個血樣采自貴陽三聯乳業公司第二奶牛場，務川黑牛45個血樣采自貴州務川仡佬族苗族自治縣仡佬牧業公司牛場。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與DNA池的構建 使用血液基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取牛的基因組DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質量，使用紫外分光光度計測定DNA樣品濃度，每個樣品測3次，取平均值。將務川黑牛和貴州荷斯坦奶牛DNA樣品濃度分別調至100 ng/μL，各取5 μL混合構建兩個DNA池。

1.2.2 引物設計和PCR擴增 根據牛SOCS6基因（GenBank登錄號：AC_000181.1）DNA序列，設計1對特異性引物擴增SOCS6基因5′調控區和第1外顯子部分序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。PCR反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master Mix試劑12.5 μL，上、下游引物（濃度為10 pmol/μL）各1.5 μL，基因組DNA 2.5 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，60.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，純化回收后的PCR產物送諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 生物信息學軟件是根據數學模型或不同的算法來預測結果，不同的軟件可能會因為計算方法或閾值設定差異而得到不同的預測結果，利用不同的軟件進行比較分析可以最大限度地提高預測的準確性，充分發揮其參考價值。將突變序列分別遞交在線軟件進行預測，并對序列突變之后軟件預測的結果進行分析，用Promoter SCAN、Neural Network Promoter Prediction、Promoter 2.0進行啟動子預測；TFSEARCH、Softberry、GeneBuilder預測轉錄因子結合位點；Bio-soft、MethPrimer和Webgene預測CpG島，分析突變對CpG島范圍、起始位置和GC含量等的影響。

2 結果與分析

2.1 DNA池的PCR擴增

利用構建的DNA池PCR分別擴增出務川黑牛和貴州荷斯坦奶牛SOCS6基因目的序列967 bp（圖1）。將PCR擴增產物膠回收純化后雙向測序，經BLAST比對分析發現4個SNP位點，假設SOCS6基因第1外顯子第1位為+1位，4個SNP位點分別為：T-513G、C-401T、A-332G、T-180G（圖2）。經比對發現，T-513G為新發現SNP位點，將該位點信息提交到SNP數據庫（登錄號為ss538994478）。在這兩個牛種中，4個SNP位點均表現出相似的多態性特征，推測這4個SNP位點可能普遍存在不同牛種中。

2.2 SOCS6基因啟動子預測

利用3種軟件對所得的SOCS6基因5′調控區序列進行啟動子預測（表2）。除Promoter 2.0外，其他2種軟件均預測得到核心啟動子區，說明SOCS6基因具有明顯的啟動子識別特征。Neural Network Promoter Prediction發現一個可能的核心啟動子區域。Promoter SCAN預測在-667 bp存在核心啟動子區域。研究發現T-513G、A-332G位點位于核心啟動子區域，該突變可能會對SOCS6基因調控表達有影響。

2.3 SOCS6基因5′調控區轉錄因子結合位點預測

使用TFSEARCH、GeneBuilder、Softberry對SOCS6基因轉錄因子結合位點進行預測及綜合分析（表3）。軟件評分以10分為滿分，評分越高說明預測的準確性和可信度越高。預測結果表明，SOCS6基因序列中包含ETF、SP1、AP-1、NF-κB、AP-4、Hb、ADR1、SRY、HSF、C/EBP、CdxA、MyoD等重要調控轉錄因子結合位點，含有TATA box、GATA box、GC box等啟動子重要元件。將突變的序列再次提交，比對后發現突變造成轉錄因子結合位點明顯變化。TFSEARCH軟件預測結果表明，T-513G突變附近原本存在的MZF1和HSF轉錄因子結合位點消失了；T-401C突變導致該處存在的AML-1a、Brn-2結合位點消失。A-332G突變導致-339 bp出現新的GCN4、cap結合位點；T-180G突變導致該位點出現一個新的E2F轉錄因子結合位點。研究發現SNP導致轉錄因子結合位點發生較大改變，造成部分原結合位點消失及新結合位點產生，這可能對SOCS6基因表達調控發揮作用。

2.4 SOCS6基因5′調控區CpG島預測

啟動子區CpG島通常處于非甲基化狀態，可與特異性轉錄因子結合，但異常甲基化的CpG島顯著降低與反式作用因子的結合活性，DNA甲基化可直接干擾特異性轉錄因子EZF、CREB、APZ等與啟動子序列結合抑制基因表達[10]。用Webgene、Bio-soft、MethPrimer 3種生物信息學軟件預測目標序列CpG島，判定標準為GC含量>50%，Obs/Exp比值>0.6和CpG島范圍>100 bp，以轉錄起始位點為0位，上、下游分別以正、負號標明，Webgene和Bio-soft軟件均預測到在目標序列中有CpG島存在，兩者預測結果一致。C-401T、A-332G位點均處于各軟件預測的CpG島區，但對核心啟動子范圍和起始位點無明顯影響，提示SNP位點通過影響SOCS6基因啟動子區甲基化水平來調控基因表達的可能性較小。

3 小結與討論

細胞因子信號抑制子家族在JAK-STAT信號通路中起負調控作用，該家族主要包含CIS和SOCS 1～7共8個成員[11]。SOCS6蛋白與人類癌癥、腫瘤、糖尿病等疾病相關，在病變組織中SOCS6基因的mRNA表達水平通常較低。在成纖維細胞中加入血清或胰島素會瞬時提高SOCS6蛋白表達量[12]。SOCS6蛋白對胰島素信號通路有重要調控作用，胰島素刺激后SOCS6蛋白與胰島素受體結合從而抑制ERK1/2、蛋白激酶B和IRS1活性[13]，并通過與IRS-2、IRS-4和磷酸肌醇的p85亞基相互作用調控胰島素受體信號[14]。此外，SOCS6蛋白對造血中重要的生長因子受體Fit3有負向調控作用，Fit3配體誘導SOCS6蛋白酪氨酸磷酸化，隨后SOCS6蛋白直接與Fit3蛋白的磷酸酪氨酸591和919位點結合，促進Fit3蛋白化進而降解，抑制細胞擴增[15]。SOCS6蛋白還能作用于線粒體誘導其斷裂，進而通過調控線粒體動力學和凋亡水平影響機體能量代謝[16]。

DNA池是一種將同種屬樣本調整為相同濃度后構建混合池的方法，具有提高檢測效率，縮短試驗周期，降低成本等優點[17]。本研究采用該方法在SOCS6基因5′調控區篩選到4個SNP位點，T-513G為新發現SNP位點（登錄號為ss538994478）。運用不同軟件預測核心啟動子區域會有一定差異，多種軟件綜合分析則可最大限度提高預測準確性。SOCS6基因5′調控區具有TATA box、GC box、CATT box等啟動子特征，T-513G、A-332G位點位于核心啟動子區域，其突變可能在調控SOCS6基因表達中發揮重要作用。4個SNP位點突變均導致不同轉錄因子原有結合位點消失，產生新結合位點，提示突變位點可直接影響特異轉錄因子與調控序列的結合。DNA甲基化可顯著降低靶基因表達水平，生物信息學軟件預測SOCS6基因啟動子區域具有范圍相同的CpG島，說明DNA甲基化水平對SOCS6基因表達調控有重要作用。本研究發現的SNP位點處于各軟件預測的CpG島區，但對核心啟動子范圍和起始位點無明顯影響，顯示SNP位點不在甲基化水平上影響SOCS6基因表達水平。SOCS6基因SNP分析為進一步研究牛SOCS6基因啟動子功能，闡明其蛋白作用機制奠定基礎。

參考文獻：

[1] TAMIYA T， KASHIWAGI I， TAKAHASHI R， et al. Suppressors of cytokine signalling（SOCS） proteins and JAK/STAT pathways[J]. Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology，2011，31（5）：980-985.

[2] YOSHIMURA A， YASUKAWA H. JAK's SOCS： A mechanism of inhibition[J]. Immunity， 2012，36（2）：157-159.

[3] KIU H， NICHOLSON S. Biology and significance of the JAK/STAT signalling pathways[J]. Growth Factors，2012，30（2）：88-106.

[4] STARR R， WILLSON T A， VINEY E M， et al. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling[J]. Nature，1997， 387（6636）：917-921.

[5] HWANG M N， MIN C H， KIM H S， et al. The nuclear localization of SOCS6 requires the N-terminal region and negatively regulates Stat3 protein levels[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，360（2）：333-338.

[6] ZADJALI F， PIKE A C， VESTERLUND M， et al. Structural basis for c-KIT inhibition by the suppressor of cytokine signalling 6 （SOCS6） ubiquitin ligase[J]. J Biol Chem，2011，286（1）：480-490.

[7] NICHOLSON S E， WILLSON T A， FARLEY A， et al. Mutational analyses of the SOCS proteins suggest a dual domain requirement but distinct mechanisms for inhibition of LIF and IL-6 signal transduction[J]. The EMBO Journal，1999，18（2）：375-385.

[8] KREBS D L， UREN R T， METCALF D， et al. SOCS-6 binds to insulin receptor substrate 4 and mice lacking the SOCS-6 gene exhibit mild growth retardation[J]. Molecular and Cellular Biology，2002，22（13）：4567-4578.

[9] FUJIMOTO M， NAKA T. Regulation of cytokine signalling by SOCS family molecules[J]. Trends in Immunology，2003，24（12）：659-666.

[10] WANG T， GAO Q， NIE P， et al. Identification of suppressor of cytokine signalling （SOCS） 6， 7， 9 and CISH in rainbow trout Oncorhynchus mykiss and analysis of their expression in relation to other known trout SOCS[J]. Fish Shellfish Immunology，2010，29（4）：656-667.

[11] DELGADO-ORTEGA M， MELO S， MEURENS F. Expression of SOCS1-7 and CIS mRNA in porcine tissues[J]. Vet Immunol Immunopathol，2011，144（3-4）：493-498.

[12] TAMURA G， YIN J， WANG S， et al. E-Cadherin gene promoter hypermethylation in primary human gastric carcinomas[J]. Journal of the National Cancer Institute，2000，92（7）：569-573.

[13] KREBS D L，HILTON D J. SOCS： Physiological suppressors of cytokine signalling[J]. Journal of Cell Science，2000， 113（16）：2813-2819.

[14] LI L， GR？覫NNING L M， ANDERSON P O， et al. Insulin induces SOCS-6 expression and its binding to the p85 monomer of phosphoinositide 3-kinase， resulting in improvement in glucose metabolism[J]. Journal of Biological Chemistry，2004，279（33）：34107-34114.

[15] KAZI JU， SUN J， PHUNG B， et al. Suppressor of cytokine signaling 6 （SOCS6） negatively regulates Fit3 signal transduction through direct binding to phosphorylated tyrosines 591 and 919 of Fit3[J]. J Biol Chem，2012，287（43）：36509-36517.

[16] LIN H Y， LAI R H， LIN S T， et al. Suppressor of cytokine signalling 6（SOCS6） promotes mitochondrial fission via regulating DRP1 translocation[J]. Cell Death Differ，2013，20（1）：139-153.

[17] SHAM P， BADER J S， CRAIG I， et al. DNA pooling： A tool for large-scale association studies[J]. Nature Reviews Genetics，2002，3（11）：862-871.