復合酶輔助提取金銀花葉中黃酮工藝和動力學研究

摘要：為了探索采用恒溫水浴法從金銀花（Lonicera japonica）葉中提取黃酮的最佳試驗方法及條件，采用單因素試驗考察了酶種類和加入量、攪拌速度、提取溫度、金銀花葉粉末粒度、提取時間等因素對黃酮提取率的影響，采用正交試驗獲得在復合酶存在下提取金銀花葉中黃酮的最佳試驗條件，并用常規動力學模型進行驗證。結果表明，復合酶的加入有利于金銀花葉中黃酮的提取，其最佳條件為80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、攪拌速度800 r/min、提取時間40 min。當提取溫度低于353 K，常規提取受動力學控制；若提取溫度高于353 K，過程將不再受動力學控制。

關鍵詞：金銀花（Lonicera japonica）葉；黃酮；復合酶輔助提取；動力學

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3943-04

金銀花（Lonicera japonica）因含有多種黃酮類化合物而被用作中藥材和功能食品，現代醫學研究表明，黃酮類化合物可以降低心肌耗氧量，增加冠脈和腦血管血流量，具有軟化血管、降血糖和降血壓等功效，同時，它還是一種天然的抗氧化劑，可以清除人體中超氧離子自由基，具有抗衰老、增強機體免疫力的作用[1，2]。目前國內外研究比較多的是從金銀花中提取黃酮，提取研究較多的是用水/乙醇提取、微波輔助萃取、超聲波輔助提取等方法[2]，而對于產量更大的金銀花葉的研究較少，在相當長的一段時間里金銀花葉被視為金銀花藥材的副產物而被廢棄掉。實際上，金銀花葉的抑菌效果與花相同甚至高于花，葉中的黃酮含量高于花，是花中的2.78倍[3]。

廣西有豐富的金銀花種質資源，但金銀花葉還沒得到很好的開發和利用，為了尋找經濟有效的提取方法，嘗試了幾種常規技術[4]提取金銀花葉中的黃酮，發現提取方法、工藝條件對黃酮的提取率和穩定性有較大影響，比如在溶劑的選擇方面，乙醇比水的提取效果好但成本較高，而在相同的條件下，超聲波輔助提取黃酮的平均提取率為2.13%，而恒溫水浴常規攪拌提取的提取率達到了3.27%以上，這可能是因為葉子比重小，易漂浮于溶劑表面的原因。另外，與金銀花相比，葉子的結構和組成不同，含有大量的纖維和果膠，如果不加酶直接提取，黃酮的提取率較低，添加復合酶可以破壞纖維和果膠，有利于金銀花葉中黃酮的提取。基于上述的試驗探索和分析，研究采用恒溫水浴法從金銀花葉中提取黃酮，并通過正交試驗獲得其最佳試驗方法及條件，獲得過程的動力學模型，這些研究可為今后實現從金銀花葉中提取黃酮的工業化和實現資源的綜合利用提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金銀花葉（干品）產自廣西壯族自治區桂林市，蘆丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所，其他化學試劑均為分析純。UV-960紫外-可見分光光度計購自澳大利亞GBC公司，JJ-4六連同步（測速）電動攪拌器購自江蘇金壇市金偉實驗儀器廠，HH-S6數顯恒溫水浴鍋購自金壇市醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.2 黃酮的提取 取10 g金銀花葉粉末，加20 mL水以及適量的酶，調節pH，在適當的溫度、時間以及攪拌速度下進行提取，過濾，取上清液0.2 mL于比色管中，加入0.3 mL 50 g/L NaNO2搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 100 g/L Al（NO3）3搖勻放置6 min，再加入4 mL 40 g/L NaOH搖勻，再加入無水乙醇定容到10 mL，放置12 min，用分光光度法測定黃酮濃度，按照下式計算黃酮提取率Y。Y=（10×Ct×V）×100%/（0.2×10×1 000）。其中，Ct為待測液黃酮濃度（mg/mL），V為提取液總體積（mL），公式分子的10 mL為定容的體積，公式分母的0.2 mL為取樣的上清液的體積，公式分母的10 g為金銀花葉粉末的質量，1 000是單位換算系數。

1.2.3 動力學模型的選擇 采用文獻[5]推導的動力學方程進行驗證。

1.2.4 單因素試驗 選取了影響黃酮提取率的提取溫度、攪拌速度、提取時間、酶的用量、酶的質量比、金銀花葉粉末粒度6個因素，分別進行單因素試驗，考察各因素對黃酮提取率的影響。①提取溫度的影響。分別選取50、60、70、80、90、100 ℃作為提取溫度進行試驗，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，轉速為800 r/min，提取時間為50 min。②攪拌速度的影響。分別選取500、600、700、800、900 r/min作為攪拌速度，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，提取溫度為80 ℃，提取時間為50 min。③提取時間的影響。考察不同的提取時間20、30、40、50、60、70 min對黃酮提取率的影響，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，轉速為800 r/min，提取溫度為80 ℃。④酶的用量的影響。用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水，轉速為800 r/min，提取時間為50 min，改變纖維素酶和果膠酶總的用量，取值0.06、0.08、 0.10、0.12、0.14、0.16 g。⑤酶的質量比的影響。改變纖維素酶和果膠酶這兩種酶的質量比，分別取0∶1、1∶3、1∶1、1∶3、3∶0，其他條件為提取溫度80 ℃、金銀花葉粉末粒度0.841 mm、酶的用量0.12 g、轉速800 r/min、提取時間50 min。⑥金銀花葉粉末粒度的影響。將曬干的金銀花葉粉碎到不同的程度，篩分成粒度分別為0.147、0.177、0.420、0.841、2.000 mm，其他條件分別是提取溫度80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、轉速800 r/min、提取時間50 min。

1.2.5 正交試驗 根據以上的單因素試驗結果，選取5個因素、各4個水平進行正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知，隨著提取溫度升高，提取率先升高，在50～70 ℃時，提取率升高很緩慢，在70～80 ℃時，提取率升高較快，但90 ℃后提取率快速下降。這主要是因為提取溫度升高有利于傳質的進行，可以加快黃酮向溶劑的擴散，但提取溫度超過90 ℃，水分揮發速度加快，溶劑減少，阻礙溶質的擴散，同時高溫下黃酮的熱穩定性下降，兩方面的原因導致黃酮提取率急劇降低。

2.1.2 攪拌速度的影響 由圖2可知，攪拌速度小于700 r/min時，提取率隨著攪拌速度的增大而迅速提高，而當攪拌速度大于700 r/min時，提取率隨著攪拌速度的增大而平緩提高，800 r/min后提取率基本保持不變，這是因為提取過程是黃酮從金銀花葉顆粒擴散到溶液的過程，當攪拌速度小于800 r/min時，過程受外擴散控制，當攪拌速度大于800 r/min時，外擴散不再是動力學控制步驟，提取率不再受其影響。

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可知，隨著提取時間的增加，黃酮提取率呈現增加趨勢，但提取50 min后黃酮提取率變化不大。

2.1.4 酶的用量的影響 由圖4可知，酶的用量越高，黃酮提取率越高，但考慮經濟方面，酶的用量不宜太高，以減少投入的成本。

2.1.5 酶的質量比的影響 由圖5可知，只用一種酶不如兩種酶復合應用的效果好，兩種酶復合應用的質量比以1∶1的效果最佳。

2.1.6 金銀花葉粉末粒度對黃酮提取率的影響 由圖6可知，當金銀花葉粉末粒度減少時，黃酮提取率迅速提高，但粒度減小為0.420 mm后，黃酮提取率基本不變，而且粒度越小提取后溶液越難過濾。綜合考慮取0.420 mm作為金銀花葉的最佳粉末粒度。

2.2 正交試驗結果

由表2可知，5個因素對黃酮提取率的影響為：提取溫度>酶的用量>提取時間>酶的質量比>攪拌速度，結合節能角度考慮，最佳提取條件是提取溫度80 ℃、酶的用量0.12 g、酶的質量比1.00∶1.00、攪拌轉速800 r/min、提取時間40 min。

2.3 驗證試驗結果

利用正交試驗中的最佳條件重復3次試驗，得到黃酮提取率分別是4.58%、4.61%、4.62%，平均提取率為4.60%，說明正交試驗的結果是可信的。

2.4 提取過程的動力學分析

3 結論

在復合酶存在下采用恒溫水浴法提取金銀花葉中黃酮，各因素的影響為：提取溫度>酶的用量>提取時間>酶的質量比>攪拌速度，最佳提取條件為：提取溫度80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、攪拌速度800 r/min、提取時間40 min，黃酮的平均提取率可達4.60%。當提取溫度低于353 K，該提取過程受動力學控制；若提取溫度高于353 K，該提取過程將不再受動力學控制。

參考文獻：

[1] 羅 磊，郭曉園.金銀花提取液抗氧化活性研究[J].食品科學，2009，30（21）：63-65.

[2] 丁利君，吳振輝，蔡創海，等.金銀花中黃酮類物質最佳提取工藝的研究[J].食品科學，2002，23（2）：62-65.

[3] 潘秋文.金銀花葉的研究進展[J].浙江中醫學院學報，2004， 28（4）：90.

[4] 王麗婷，趙 堂，楊敏麗.金銀花葉中黃酮類物質的提取工藝[J].華西藥學雜志，2006，21（6）：520-523.

[5] 儲茂泉，劉國杰.中藥提取過程的動力學[J].藥學學報，2002， 37（7）：559-562.