外植體和植物生長調節劑對盾葉薯蕷愈傷組織誘導的影響

摘要：以盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）莖段和葉片為外植體，研究了不同植物生長調節劑對盾葉薯蕷愈傷組織誘導的影響。結果表明，莖段作外植體更有利于盾葉薯蕷愈傷組織的誘導，最佳的愈傷組織誘導培養基為MS+1.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，誘導30 d時愈傷組織誘導率達100%，愈傷組織為淺黃色、質地疏松、顆粒狀；以葉片為外植體，愈傷組織誘導培養基中添加1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA時誘導率最高，為93.75%。盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線呈“S”型，0～12 d為延遲生長期，增重緩慢；12～30 d為指數生長期，生長旺盛，增殖迅速；30～36 d為緩慢生長期，因此誘導的愈傷組織需在接種后30 d內繼代培養。

關鍵詞：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）；外植體；植物生長調節劑；愈傷組織

中圖分類號：S632.1；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3693-04

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）是薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞草本植物，又名黃姜，火頭根等，為中國特有種[1]，主要分布于四川、湖北、湖南、云南和陜西等地[2]，其根莖富含的薯蕷皂素是合成甾體激素和甾體避孕藥的主要原料[3]，可用于治療冠心病和心血管病，也可用于抗癌、防衰老、避孕和治療多種疾病，還是滅殺釘螺、防治血吸蟲的理想藥物，在醫藥界有“藥用黃金”的美稱。由于早些年只采不栽，已使盾葉薯蕷野生資源面臨枯竭[4]。合理開發利用盾葉薯蕷資源，改變其資源短缺的局面十分迫切。盾葉薯蕷的人工栽培雖緩解了薯蕷皂素生產中原料不足的矛盾，但普遍存在薯蕷皂素含量低和種質退化的問題[5]。因此，選育薯蕷皂素含量高的盾葉薯蕷優良單株，并建立高效的快速繁殖體系在盾葉薯蕷商業化栽培中具有重要意義。隨著生物技術的發展，利用組織培養技術對藥用植物進行品種的改良及快速繁殖，可以更加方便、快捷和大量地得到有效成分含量較高的植株，具有廣泛的應用前景。本研究以盾葉薯蕷試管苗的莖段和葉片為外植體，研究了不同植物生長調節劑種類和濃度組合對愈傷組織誘導的影響，并繪制愈傷組織的生長曲線，以期為盾葉薯蕷優良高產無性系的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盾葉薯蕷試管苗來自河南師范大學“四大懷藥”組織培養研究室。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組的誘導 在超凈工作臺上將試管苗葉片切成面積約0.5 cm×0.5 cm的小塊，莖段切成長1.5 cm左右的小段，分別接種到愈傷組織誘導培養基中。愈傷組織誘導培養基以MS為基本培養基，含3%的蔗糖和0.6%的冷凝脂，調pH為6.0，121 ℃滅菌20 min，分別添加不同的植物生長調節劑組合2，4-D（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）或NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）。培養條件為培養溫度（25±2） ℃、光照度2 000 lx、光照時間14 h/d。觀察愈傷組織的生長情況，30 d時統計并記錄愈傷組織誘導率、愈傷組織量和愈傷組織生長情況。

愈傷組織誘導率=形成愈傷組織的外植體個數/接種的外植體總數×100%。

1.2.2 愈傷組織的繼代培養及生長曲線的繪制 將誘導形成的愈傷組織轉入篩選出的最佳誘導培養基中進行繼代培養，每瓶接種3.0 g。接種后每3天取樣1次，每次隨機選取3瓶材料，稱其鮮重，取平均值，以愈傷組織增重量（g/L）為縱坐標、培養時間（d）為橫坐標繪制愈傷組織的生長曲線。

愈傷組織增重量（g/L）=收獲量（g/L）-接種量（g/L）

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑對莖段外植體愈傷組織誘導的影響

以長1.5 cm左右的莖段作外植體，分別接種在含不同植物生長調節劑濃度組合的愈傷組織誘導培養基上，接種后8 d莖段兩端出現膨大跡象，部分莖段從中央開始膨大；11 d后從膨大處誘導出白色、顆粒狀的愈傷組織（圖1A）；隨培養時間的延長，愈傷組織的量也逐漸增多，逐漸覆蓋住整個莖段，愈傷組織顏色和質地也有變化（圖1B）。30 d時盾葉薯蕷莖段外植體愈傷組織的誘導情況見表1。從表1可以看出，6-BA濃度相同時愈傷組織誘導率隨2，4-D濃度的升高呈升高趨勢，而2，4-D或NAA濃度相同時愈傷組織誘導率隨6-BA濃度的升高總體呈升高趨勢。其他條件相同時，添加NAA與6-BA的培養基中愈傷組織的誘導率和愈傷組織量均低于添加2，4-D與6-BA的培養基，誘導率最高為93.75%，最低僅為75.00%。培養基中添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA時愈傷組織誘導率最高，達100.00%，愈傷組織淺黃色、質地疏松、呈顆粒狀，且誘導形成的愈傷組織量也較大。

2.2 植物生長調節劑對葉片外植體愈傷組織誘導的影響

以面積約為0.5 cm×0.5 cm的葉片作外植體，分別接種在含不同植物生長調節劑濃度組合的愈傷組織誘導培養基上。觀察發現，接種后9 d葉片邊緣切口處開始褪綠、卷曲并膨大；12 d時開始出現少量白色顆粒狀愈傷組織（圖2A）；隨培養時間的延長，愈傷組織的量也逐漸增加，在葉片中央也逐漸開始形成白色點狀的愈傷組織（圖2B）。有部分葉片不能誘導形成愈傷組織，葉片在培養過程中逐漸變黃、變褐，然后死亡。30 d時盾葉薯蕷葉片外植體愈傷組織的誘導情況見表2。從表2可以看出，培養基中添加NAA和6-BA時，葉片外植體的愈傷組織誘導率較低，最高為56.25%，最低僅為27.78%。培養基中添加2，4-D和6-BA，葉片外植體的愈傷組織誘導效果較好，6-BA濃度一定時，愈傷組織誘導率隨2，4-D濃度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，而2，4-D濃度相同時，培養基中添加1.0 mg/L 6-BA的誘導效果比添加0.5 mg/L 6-BA時差。培養基中植物生長調節劑組合為1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA時愈傷組織誘導率最高，為93.75%，愈傷組織呈淺黃色、質地疏松、顆粒狀，且誘導形成的愈傷組織量也較大。

2.3 愈傷組織生長曲線的繪制

盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，盾葉薯蕷愈傷組織的生長曲線呈“S”型，可分為延遲生長期、指數生長期和緩慢生長期3個時期。0～12 d為延遲生長期，愈傷組織增重緩慢，可能是由于接種初期愈傷組織對培養基內營養成分吸收不充分所致。12～30 d為指數生長期，愈傷組織生長旺盛，增殖迅速。隨著培養基中營養物質的消耗和代謝產物的積累，愈傷組織生長逐漸變慢，并開始出現衰老跡象，愈傷組織進入緩慢生長期（30～36 d）。因此，愈傷組織需在培養后30 d內繼代，以保持其旺盛的分裂能力和細胞活性。

3 小結與討論

3.1 外植體類型對愈傷組織誘導的影響

已有的研究結果表明，盾葉薯蕷不同類型外植體誘導愈傷組織的效果并不相同。本試驗用盾葉薯蕷的莖段和葉片作為外植體誘導愈傷組織，發現外植體對愈傷組織誘導的影響較大，且莖段作為外植體時誘導效果要優于葉片。李瓊等[6]分別以盾葉薯蕷莖尖、葉片和幼嫩果莢為外植體誘導愈傷組織，結果發現莖尖外植體出愈率高，不易污染，且愈傷組織誘導時間短，是組織培養較理想的外植體材料。莫英等[7]比較了莖段、葉片和葉柄對愈傷組織誘導形成的影響，結果也認為以莖段為外植體誘導愈傷組織效果最佳。綜合看來，莖段或莖尖更適合作為誘導盾葉薯蕷愈傷組織的外植體。

3.2 植物生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

生長素類物質是最早被發現的植物激素[8]，它作為一類重要的生長調節物質，影響細胞的分裂、伸長、細胞形態建成、根的發育、頂端優勢以及對光和重力的響應等多種生理過程[9]。NAA在較低濃度下促進細胞生長，在高濃度下促進細胞成熟衰老。本研究結果表明，在本試驗設計的生長素濃度范圍內（2，4-D 0.5～1.5 mg/L，NAA 0.5～1.5 mg/L），2，4-D促進盾葉薯蕷莖段和葉片外植體愈傷組織誘導的效果要好于NAA，添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA的培養基中莖段外植體愈傷組織誘導率達100%。晏嬰才等[10]認為，在0.5～2.0 mg/L范圍內，2，4-D誘導盾葉薯蕷愈傷組織的效果明顯優于NAA；在6-BA的濃度相同的情況下，同濃度2，4-D的誘導率顯著高于NAA，這與本研究的結果是一致的。

參考文獻：

[1] 郭永兵，李 峰. 腐植酸對盾葉薯蕷種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 湖北農業科學，2010，46（2）：256-258.

[2] 張曉麗，郭 婧，龔玉佳，等. 盾葉薯蕷頂芽快繁技術研究[J]. 河南農業科學，2012，41（4）：128-131.

[3] SAUTOUR M， MITAINE-OFFER A-C， LACAILLE-DUBOIS M-A. The dioscorea genus： A review of bioactive steroid saponins[J]. Journal of Natural Medicines，2007，61（2）：91-101.

[4] 董靜洲，易自力，蔣建雄，等. 盾葉薯蕷綜合研究概況[J]. 湖北農業科學，2004（2）：84-88.

[5] 黃賢蘭，郭華春. 不同倍性盾葉薯蕷的核型分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2012，20（3）：256-262.

[6] 李 瓊，李 靜，姜 玲，等.盾葉薯蕷愈傷組織的誘導及芽分化與增殖[J]. 貴州農業科學，2010，38（7）： 15-17.

[7] 莫 英，蘭利瓊，卿人韋，等.盾葉薯蕷種子萌發條件及誘導外植體愈傷的研究[J].四川大學學報（自然科學版），2004，41（4）：837-841.

[8] 周 索，余曉麗，楊建偉，等. 異三聚體G蛋白在NAA誘導的擬南芥根生長發育中的作用[J].西北植物學報，2006，26（8）： 1617-1620.

[10] 晏嬰才，林宏輝，代其林，等. 盾葉薯蕷組織培養與快速繁殖研究[J]. 四川大學學報 （自然科學版），2002，39（1）：136-140.