蛋清中溶菌酶提取技術的研究

趙喜喬 趙榮昊 張夢熙 吳漢東

溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種葡萄糖苷酶。它是英國細菌學家弗萊明于1922年在鼻粘液中發現的強力殺菌物質。溶菌酶的發現是近代酶化學研究的最大成果之一。

雞蛋清中的溶菌酶是研究得最清楚的一種溶菌酶。它是一種純品為白色或微黃色的結晶體，化學性質穩定，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇的堿性球蛋白。它能夠催化某些細菌細胞壁多糖的水解，從而溶解這些細菌的細胞壁。由于溶菌酶本身是一種天然蛋白質，無毒性，廣泛應用于臨床醫學、食品工業、發酵工程、基因工程、細胞工程等，溶菌酶所具有的廣泛用途被國內外眾多學者所研究。為此本試驗在結合實驗室現有條件對雞蛋清溶菌酶的提取技術進行了探究。

一、材料與方法

（一）材料

市售新鮮雞蛋；枯草芽孢桿菌；標準蛋白Marker；724樹脂；聚乙二醇4000：樣品溶解液；濃縮膠；電極緩沖液；固定液；染色液；脫色液等常用化學試劑。

（二）方法

（1）溶菌酶的提取及純化

雞蛋清樣品制備及粗分離。將洗凈的4～5個新鮮雞蛋打破，分離得雞蛋清，量其體積，加入兩倍蛋清體積的去離子水，攪拌拌勻，過濾雜質，然后用1mol/L的HCI溶液調pH值至7.0左右，再用脫脂棉過濾收集濾液。

724弱酸性陽離子交換樹脂的再生及層析。

724樹脂再生處理：首先將干樹脂清水浸泡，充水膨脹除去細小顆粒和較大雜質；1mol/L的HCI溶液浸泡4～6 h，用去離子水洗至pH值接近5.5；1 mol/L的NaOH浸泡6 h，去離子水洗至近中性；再用1mol/L的NaCl溶液處理6 h，使之轉型為Na+型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加0.151mol/L、pH值為6.5的磷酸緩沖液平衡，待用；吸干緩沖液后，將處理好的蛋清約200ml，加入約32 g再生的724樹脂中，緩慢攪拌吸附6 h，4℃靜置過夜。

洗滌、洗脫：待分層后，將蛋清液倒去，用去離子水反復沖洗，以去除雜蛋白。濾干樹脂，用等體積的0.15mol/L pH值為6.5的磷酸緩沖液洗滌，加入等量的10%（NH4）2SO4溶液攪拌洗脫30 min，使溶菌酶從樹脂上洗脫下來。收集洗脫液.4℃冰箱靜置過夜。次日，有白色沉淀析出，離心收集沉淀，沉淀物為溶菌酶粗產品。

聚乙二醇濃縮：鹽析物用1倍去離子水溶解成稀糊狀。裝入透析袋.在裝有聚乙二醇的試管中吸水濃縮，收集濃縮液；透析除鹽、去堿性蛋白：4℃條件下，用去離子水透析24 h左右.離心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入l mol/L氫氧化鈉溶液.同時不斷攪拌，使pH值上升至8.0～9.0，如有白色沉淀，即離心去除。

冷凍干燥：用3 mol/L鹽酸調pH值至5.0.冷凍干燥。即得白色片狀溶菌酶。

（2）溶茵酶的檢測

溶菌酶得率：收集冷凍干燥后留在培養皿上的白色粉末，稱重。

純度檢測：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。①凝膠板的制備：用30%分離膠貯液、pH值為8.9分離膠緩沖液、10%濃縮膠貯液、pH值為6.7濃縮膠緩沖液、10%SDS、1%TEMED、重蒸餾水、10%APS溶液配制而成；②溶菌酶的處理：用磷酸緩沖液點樣于凝膠板上；③電泳：電流為10mA，時間4 h；④固定、染色和脫色：電泳完畢，將膠板從玻璃板上取下，分別在固定液與染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干凈。再用脫色液脫色。

溶菌酶活力測定：①菌懸液的制備：將培養24 h的枯草芽孢桿菌用蒸餾水將菌體從培養基上洗下，4000r/min離心20 min，傾去上清液。用冷丙酮洗滌，4000r/min離心20 min.不溶物即為菌體。取5mg菌體，加入30mL，0.1mol/L pH值為6.2的磷酸緩沖液，制備菌懸液，于波長450 nm處測定吸光值（A值）；②酶液的制備：稱取溶菌酶粉末5mg，用0.1 mol/L， pH值為6.2的磷酸緩沖液配成l mg/mL的酶液。使用時稀釋20倍；③活力測定：將酶液和底物懸液分別置于25℃水浴保溫10～15min.吸取菌懸液2.8 mL，然后加入酶液0.2mL，迅速搖勻。每隔1min測定1次A450值，共測4次，計算酶的活力單位。

二、結果與分析

（一）724樹脂再生

在實驗過程中再生前的724樹脂，呈深褐色；經過1mol/l的HCI溶液浸泡4 h水洗后的樹脂，呈淺黃色；經過1mol/l NaOH溶液浸泡6 h水洗后的樹脂，樹脂變為肉色；吸附蛋清后的樹脂，顏色發白，變得很黏稠。

（二）溶菌酶提取及檢測

（1）溶茵酶的得率及純度檢測

將冷凍干燥后收到的溶菌酶稱重，約為0.0317g。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳純度檢測。從標準蛋向Marker的條帶來看，最下面的1條帶為溶菌酶的條帶，分子量為14.4kD，與之相對應右邊的蛋白樣品中也分離得到了溶菌酶的條帶，而且加樣量越大顏色越深。結果表明，該方法從雞蛋清中分離出的溶菌酶純度較高，大部分的雜蛋白已除去，而且加樣量越大顏色越深。顏色的深淺與染料的選擇及濃度和染色時間有關，一般染料濃度越高，染色時間越長，染色越深。但脫色也更難。在本試驗中，固定染色0.5h比較合適，脫色時在搖床上洗脫過夜效果最好。

（2）溶菌酶活力檢測 表1為加入溶菌酶后.枯草芽孢桿菌在4 min內.每隔l min所測的吸光值。根據酶活力計算公式。算出該酶的活力。結果表明。所提取溶菌酶的活力為7793 U/mg。

表1加入溶菌酶后枯草芽孢桿菌的吸光值項目

三、討論

目前溶菌酶的提取主要就是對蛋清先粗提再純化的一個過程。本試驗在實施過程中，根據試驗相關材料的理化性質，對試驗步驟做了一些改進.以期達到更好的效果。如724樹脂經堿液浸泡過后很難洗至中性，且堿性很強。改用NACL溶液浸泡同樣可以將樹脂轉為Na+型，且很容易洗至中性。又如用10%的硫酸銨洗脫樹脂吸附的物質時。需要過柱，但因為過柱有拖尾現象，所以直接用攪拌洗脫，多洗幾次，交換也能很充分，避免了過柱的麻煩。另外，聚乙二醇濃縮和離心濃縮可交替反復使用，視具體情況而定。從試驗結果可以看到，提取出來的溶菌酶的純度和活力都比較高，說明了提取純化方法的選擇和交叉運用只要符合提取物的理化性質，都能有較好的效果，而其對溶菌酶提取效果的影響則需要進一步探究。